甘肃省陇南市核桃枝枯病菌Alternaria alternate的生物学特性

摘要 以核桃枝枯病菌（Alternaria alternate）为对象，研究温度、碳源、氮源、光照、培养基和pH等对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响。结果表明，pH 7和全黑暗有利于核桃枝枯病菌的菌丝生长、产孢和孢子萌发；25 ℃有利于菌丝生长，25～30 ℃有利于产孢，20～30 ℃有利于孢子萌发；最适生长的碳源为可溶性淀粉，氮源为酵母浸粉、KNO3和蛋白胨，最适产孢的碳源和氮源分别为山梨醇和KNO3，最适孢子萌发的碳源和氮源分别为乳糖和NH4NO3；PSA、OA和PDA培养基适合菌丝生长，LB培养基适合产孢，OA培养基适合孢子萌发。该研究结果为明确核桃枝枯病的发生规律提供理论依据，也为综合防治措施的制定提供参考。

关键词 交链格孢菌；生物学特性；测定

中图分类号 S436.621.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）17-0133-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.030

Biological Characteristics of Alternaria alternate Causing Walnut Branch Blight in Longnan City， Gansu Province

DENG Xiao-yun1， GAO Meng-chun2， YANG Cheng-de2

（1. Bailongjiang Forestry Management Bureau of Gansu Province， Lanzhou， Gansu 730000;2.College of Plant Protection of Gansu Agricultural University， Lanzhou， Gansu 730070）

Abstract The effects of temperature， carbon source， nitrogen source， light， medium and pH on mycelial growth， sporulation and spore germination rate were studied. The results showed that pH 7 and total darkness were conducive to the mycelial growth， sporulation and spore germination of Alternaria alternata; 25 ℃ was optimum to mycelial growth， 25-30 ℃ was optimum to sporulation， and 20-30 ℃ was optimum to spore germination; the optimum carbon source for mycelial growth was soluble starch， the nitrogen source was yeast extract， KNO3 and peptone， the optimum carbon source and nitrogen source for sporulation were sorbitol and KNO3， respectively， and the optimum carbon source and nitrogen source for spore germination were lactose and NH4NO3， respectively; PSA， OA and PDA medium were suitable for mycelial growth， LB medium was suitable for sporulation， and OA medium was suitable for spore germination. The results provide a theoretical basis for clarifying the occurrence rules of walnut branch blight， and also provide a reference for the comprehensive control measures.

Key words Alternaria alternate;Biological characteristics；Determination

作者简介 邓小芸（1975—），女，甘肃兰州人，工程师，从事林业有害生物研究。

通信作者，教授，博士，博士生导师，从事植物病理学研究。

收稿日期 2023-10-12

核桃（Juglans regia），又名胡桃，为胡桃科胡桃属落叶乔木，被誉为世界四大干果之一，其核桃仁含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物，并含有人体必需的钙、磷、铁等多种微量元素和矿物质，以及胡萝卜素、核黄素等多种维生素。因其具有重要的食疗、药用、观赏和生态等价值，分布和栽培遍及世界多个国家和地区，成为许多国家的重要栽培树种，也是重要的用材树种、生态树种、经济树种和生物质能源树种，具有较高的营养价值和保健功能。我国是世界上最大的核桃生产国和消费国［1］，主要分布在甘肃、山西、陕西和四川等地。随着核桃种植面积的大幅增加，核桃病害频发，严重影响核桃的正常生长，核桃产量降低，给种植区造成较大的经济损失。核桃枝枯病是一种常见真菌性病害，主要危害枝干，造成枝干枯死，一般发病率20%左右，重者可达90%。核桃枝枯病的病原各地有差别，山东主要为Diaporthe nobilis［2］，河南为葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）［3］，贵州为越橘间座壳（Diaporthe vaccinii）［4］，四川为新壳梭孢（Neofusicoccum parvum）［5］和辽宁为胡桃楸拟茎点霉（Phomopsis juglandina）［6］等。前期对采自甘肃省陇南市的核桃枝枯病病原鉴定为交链格孢菌（A.alternate），为国内首次报道引起核桃枝枯病。因此，笔者以核桃枝枯病的新病原交链隔孢菌为对象，测定其生物学特性，以期为明确甘肃省陇南市核桃枝枯病的发生规律提供理论依据，也为综合防治措施的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。核桃枝枯病菌（A.alternate），保存于甘肃农业大学植物保护学院植物病理实验室。

1.1.2 供试培养基。马铃薯葡萄糖培养基（PDA）；马铃薯蔗糖培养基（PSA）；燕麦培养基（OMA）；玉米培养基（CMA）；查彼培养基（Czapek）；水琼脂（WA）；察氏培养基（CZA）；麦芽汁琼脂培养基（MEA）；理查培养基（RCM）；胡萝卜琼脂培养基（CA）［7］。

1.2 试验方法

1.2.1 温度对菌丝生长、产孢量以及孢子萌发的影响。

病原菌培养7 d后，打取直径5 mm的菌饼接种于PDA培养基上，分别置于温度为5、15、20、25、30、35和40 ℃的恒温培养箱中培养5 d，十字交叉法测量菌落直径；培养12 d后，每个培养皿中加入无菌水10 mL，用软毛笔刷轻轻洗刷菌落孢子，用移液枪混匀并滴于血球计数板上，测定1 mL菌液的产孢量，悬滴法测定孢子萌发情况并计算孢子萌发率［8-10］；3次重复。

1.2.2 碳源、氮源对菌丝生长、产孢量以及孢子萌发的影响。

以察氏培养基为基础培养基，分别以NH4NO3、蛋白胨、尿素、酵母浸粉、NH4Cl、（NH4）2SO4、（NH4）2CO3和KNO3为氮源，以山梨醇、麦芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、肌醇、可溶性淀粉和木糖为碳源，制备不同碳源和氮源培养基。将直径5 mm的菌饼分别接种于不同碳源、氮源培养基上，置于25 ℃恒温培养箱培养［9］，其他方法同“1.2.1”。

1.2.3 光照时间对菌丝生长、产孢量以及孢子萌发的影响。

将直径5 mm的菌饼接种于PDA培养基上，分别置于完全光照（200 lx）、完全黑暗（0 lx）和光暗交替（200 lx 12 h/0 lx 12 h）的25 ℃恒温培养箱培养［11-12］。其他方法同“1.2.1”。

1.2.4 培养基对菌丝生长、产孢量以及孢子萌发的影响。

将直径5 mm的菌饼分别接种于PDA、PSA、WA、CZA、OMA、CMA、MEA、CA、RCM和Czapek培养基上，置于25 ℃恒温培养箱培养［7］，其他方法同“1.2.1”。

1.2.5 pH对菌丝生长、产孢量以及孢子萌发的影响。

用1 mol/L氢氧化钠和1 mol/L盐酸将PDA培养基的pH分别调为4、5、6、7、8、9、10和11。接种直径为5 mm的菌饼于不同pH的培养基上，置于25 ℃恒温培养箱培养［13］，其他方法同“1.2.1”。

1.3 数据处理

试验数据的整理及图表的制作采用Excel 2013和IBM SPSS Statistics。

2 结果与分析

2.1 温度对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

由图1可知，在5～40 ℃菌丝均能生长，在25 ℃时生长速度最快，菌落直径达4.92 cm，显著高于其他温度（P<0.05），表明菌丝生长的最适温度为25 ℃；在5～40 ℃下均能产孢，在25 ℃时产孢量最高，达2.01×107 CFU/mL，显著高于其他温度（P<0.05）；在40 ℃时，产孢量最少，仅为1.25×105 CFU/mL（图2），表明25 ℃最适产孢；在5～40 ℃下孢子均可萌发，在20、25和30 ℃时，萌发率分别为80.33%、88.33%和82.33%，显著高于其他温度（P<0.05），但三者间差异不显著；在40 ℃时，萌发率最低，仅为51.33%（图3），表明20～30 ℃最适孢子萌发。

2.2 碳源对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

由图4可知，在可溶性淀粉培养基上菌丝生长最快，UemhWjK9vd5nKSfp/96j4w==菌落直径最大，达5.12 cm，显著高于其他碳源（P<0.05）；在木糖培养基上生长最慢，直径仅为2.83 cm，表明可溶性淀粉为菌丝生长的最适碳源；在以山梨醇为碳源的培养基上，产孢量最高，达2.91×107 CFU/mL，显著高于其他碳源（P<0.05）（图5），表明以山梨醇为碳源最适产孢；在以乳糖为碳源的培养基上，孢子萌发最快，萌发率达91%，显著高于其他碳源（P<0.05）（图6），表明乳糖为碳源最适孢子萌发。

2.3 氮源对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

在以酵母浸粉为氮源的培养基上，病原菌生长速度最快，菌落直径达3.18 cm，以KNO3和蛋白胨为氮源的培养基上次之，三者间差异不显著；在（NH4）2CO3培养基上生长最慢，菌落直径仅为0.62 cm（图7），表明酵母浸粉、KNO3和蛋白胨是菌丝生长的最适氮源；在以KNO3为氮源的培养基上，产孢量最高，达1.34×107 CFU/mL，显著高于其他氮源（P<0.05）（图8），说明KNO3为最适产孢的氮源；在以NH4NO3为氮源的培养基上，孢子萌发最快，萌发率达91%，显著高于其他氮源（P<0.05）（图9），表明NH4NO3为最适孢子萌发的氮源。

2.4 光照时间对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

全黑暗条件下，菌丝生长最快，菌落直径达5.63 cm，显著高于其他条件（P<0.05）；全光照和12 h 光暗交替时，菌丝生长差异不显著（图10），表明全黑暗最适菌丝生长；全黑暗条件下产孢量最大，达3.58×107 CFU/mL；全光照和光暗交替条件下，病原菌产孢量较低，但差异显著（图11），说明全黑暗条件最适病原菌产孢；在全黑暗条件下，病原菌的孢子萌发最快，萌发率达92%，显著高于其他条件（P<0.05）；在全光照条件下，病原菌孢子萌发最慢，萌发率仅为74.33%，显著低于全黑暗条件（P<0.05）（图12），说明全黑暗条件最适孢子萌发。

2.5 培养基对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

病原菌在PSA培养基上生长最快，菌落直径达5.43 cm，在OA和PDA培养基上菌落直径分别为4.85和4.76 cm，与PSA无显著差异，在MEA培养基上生长最慢，菌落直径仅为2.53 cm（图13），表明PSA、OA和PDA培养基最适菌丝生长；在LB培养基上，病原菌产孢量达7.50×106 CFU/mL，显著高于其他培养基（P<0.05）（图14），说明LB培养基最适病原菌产孢；在OA培养基上，孢子萌发率达93%，显著高于其他培养基（P<0.05）（图15），说明OA培养基最适病原菌的孢子萌发。

2.6 pH对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

在pH为 4～11下病原菌均能生长，当pH为7时，菌丝生长最快，产孢量最高，孢子萌发最快，菌落直径、产孢量和萌发率分别为4.30 cm、1.14×107 CFU/mL和91%，显著高于其他pH（P<0.05）（图16～18），表明菌丝生长、产孢和萌发的最适pH为7。

3 结论与讨论

枝枯病是植物上的常见病害之一，在苹果树［13］、桃树［14］和栾树［15］等植物上均有报道，核桃枝枯病是核桃树的主要病害之一。该试验主要测定了核桃枝枯病的新病原交链格孢菌的生物学特性。该病菌的菌丝最适生长温度为25 ℃，与桃树枝枯病菌桃拟茎点霉（Phomopsis amygdali）的最适生长温度一致［14］，但低于苹果树枝枯病菌可可毛色二孢（Lasiodoplidia pseudotheobromae）的最适温度30 ℃［13］，其最适产孢温度与栾树枝枯病菌小新壳梭孢（Neofusicocuum parvrm）一致，均为25 ～30 ℃［15］。交链格孢菌的最适萌发温度为20～30 ℃，与麻风树枝枯病菌（Lasiodoplidia theobromae）一致［16］，在pH 4～11均能生长、产孢和萌发，且最适生长、产孢和萌发pH为7，与麻风树枝枯病菌［16］和小新壳梭孢［15］相比更适宜在中性环境。全黑暗条件有利于交链格孢菌的菌丝生长、产孢和萌发，但桃拟茎点霉［14］、可可毛色二孢［13］和麻风树枝枯病菌［16］等均在全光照条件下适合菌丝生长、产孢和萌发。该试验研究了核桃枝枯病病菌的生长、产孢和萌发等生物学特性，为明确其发生规律提供了理论依据，但该病害在田间具体发生规律还需进一步研究RjTuc0TFJgOazhZue413Fv+BZ5Tn94CSguBkcwsSJRc=。

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