超高效液相色谱质谱法快速测定血浆中6种蘑菇毒素

[摘要]目的建立超高效液相色谱质谱法快速测定血浆中异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽的含量。方法取血浆样本，以1∶3的比例加入乙腈，旋涡混匀1min后，以10000转/min、4℃离心3min。吸取上清液，以0.03%氨水和乙腈进行超高效液相分离，在电喷雾正离子模式下进行多反应监测检测。结果一次进样4min即可实现血浆中异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽的分离检测。血浆中6种蘑菇毒素的线性范围为40～500μg/L，检出限分别为10.0μg/L、10.0μg/L、10.0μg/L、6.0μg/L、6.0μg/L和6.0μg/L（S/N=3），相对标准偏差为0.60%～1.90%（n=11），回收率为90.8%～127.0%。结论本方法可实现血浆中包括异绒白乳菇醛在内的6种蘑菇毒素的快速同时测定，操作简单，结果准确，为中毒患者的蘑菇毒素快速确证提供技术平台。

[关键词]蘑菇毒素；快速测定；血浆；超高效液相色谱质谱法

[中图分类号]Ｏ658[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.19.002

Rapiddeterminationofsixmushroomtoxinsinplasmabyultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry

LIQi1，XUJunqing1，QIANJiaqing2，JILyu1

1.DepartmentofLaboratory，LishuiCenterforDiseaseControlandPrevention，Lishui323000，Zhejiang，China;2.SchoolofEcology，LishuiUniversity，Lishui323000，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToestablishamethodforrapiddeterminationofisovelleral，α-amanitin，β-amanitin，γ-amanitin，dihydroxy-phallotoxinandcarboxy-dihydroxy-phallotoxininplasmabyultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry.MethodsTakeplasmasamplesandaddacetonitrilesolutionina1：3ratio.Thesamplewasvortexmixedfor1min，thencentrifugatedat10000r/minand4℃for3min.Thesupernatantwasinjected，while0.03%ammoniawaterandacetonitrilewereusedasmobilephasesforultrahighperformanceliquidphaseseparation.Multireactionmonitoringwascarriedoutinthepositiveionmodeofelectricspray.ResultsTheseparationanddetectionofisovelleral，α-amanitin，β-amanitin，γ-amanitin， dihydroxy-phallotoxin ;andcarboxyl-dihydroxy-phallotoxininplasmacouldbeachievedwithin4minbyoneinjection.Thelinearrangeofsixmushroomtoxinsinplasmawas40-500μg/L，andthedetectionlimitswere10.0μg/L10.0μg/L，10.0μg/L，6.0μg/L，6.0μg/Land6.0μg/L（S/N=3），respectively.Therelativestandarddeviationswere0.60%-1.90%（n=11），andtherecoveryrateswere90.8%-127.0%.ConclusionThismethodrealizestherapidandsimultaneousdeterminationof6kindsofmushroomtoxinsinplasma，includingisovelleral.Theoperationissimpleandtheresultisaccurate，whichprovidesatechnicalplatformfortherapidconfirmationofmushroomtoxinsinpoisonedpatients.

[Keywords]Mushroomtoxin;Rapiddetermination;Plasma;Ultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry

目前全世界已知的毒蘑菇有400多种，所含毒素种类众多，结构差异大，单独或联合作用可引起复杂的临床表现[1-3]。因此，建立快速、准确、灵敏的多蘑菇毒素确证测定方法，第一时间确定蘑菇毒素种类，可为中毒患者的准确救治争取时间，对降低死亡率十分重要。液相色谱-质谱法结合液相色谱的强有效分离能力和质谱的强组分鉴定能力，特别是超高效液相色谱质谱法（ultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry，UPLC-MS）采用比普通液相色谱柱更小粒径和更高性能的色谱柱填充颗粒，具有更准确和更灵敏的优势，近年被越来越多地应用到蘑菇毒素的测定中，尤其适用于血液、尿液等复杂生物样本中低浓度蘑菇毒素的测定，在蘑菇毒素的应急诊断确证等领域发挥着越来越重要的作用[4-10]。但仍普遍存在生物样本前处理过程较为烦琐、同时测定蘑菇毒素种类有限等问题。本文通过简化生物样本的前处理过程，首次建立血浆中包括异绒白乳菇醛在内的6种蘑菇毒素的UPLC-MS快速测定方法。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

XevoTQ-S超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪（美国Waters公司）；LQ1multireax旋涡振荡器（德国Heidolph公司）；3-30K低温高速离心机（美国Sigma-Aldrich公司）；D11911超纯水器（美国ThermoFisher公司）。

异绒白乳菇醛：纯度≥99%；α-鹅膏毒素、β-鹅膏毒素、γ-鹅膏毒素、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽：纯度≥90%（美国Enzo公司）；人工H血浆（北纳生物研发中心）；甲醇、乙腈：HPLC级（德国Merck公司）；氨水：优级纯（美国ThermoFisher公司）。

1.2标准溶液的配制

用甲醇分别配制浓度均为100mg/L的异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽标准储备溶液，–20℃保存。用甲醇稀释配制浓度为1mg/L的6种蘑菇毒素混合标准中间溶液，–20℃保存。用0.03%氨水-乙腈（95∶5，V/V）配制不同浓度的异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽系列混合标准溶液。

1.3分析条件

色谱条件：ACQUITYUPLCBEHC18柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱温：35℃；样品室温度：4℃；进样体积10µl。流动相A：0.03%（V/V）氨水，流动相B：乙腈。梯度洗脱条件：0～1.0min，95%～80%A；1.0～1.2min，80%～65%A；1.2～1.8min，65%A；1.8～2.2min，65%～10%A；2.2～3.6min，10%A；3.6～4.5min，10%～95%A；4.5～6.5min，95%A。流速：0.35ml/min。

质谱条件：MRM模式，ESI+；离子源温度：150℃；毛细管电压：2.5kV；脱溶剂气温度：600℃；脱溶剂气流量：950L/h，见表1。

1.4样本前处理

取适量血浆样本，按1∶3体积比加入乙腈，涡旋振荡混匀1min，沉淀去除蛋白。以10000转/min、4℃离心3min，吸取上清液，过0.22μm微孔滤膜后待用。

1.5样本检测

取血浆样本，在1.3条件下进行血浆中异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽的同时测定，并开展系统性能实验。

1.6性能实验和计算方法

按1.2配制不同浓度的异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽系列混合标准溶液，在1.3条件下进行分离测定。分别以6种蘑菇毒素浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标，绘制工作曲线。配制高、低两个不同加标浓度的6种蘑菇毒素标准溶液，考察方法回收率。配制蘑菇毒素平行样本，重复11次测定计算方法精密度。以基线噪声3倍信号对应的浓度为方法检出限。

2结果

2.1色谱条件优化

本研究比较ACQUITYUPLCHSST3（100mm×2.1mm，1.8μm）和ACQUITYUPLCBEHC18（100mm×2.1mm，1.7μm）两种色谱柱对异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽等6种蘑菇毒素分离测定的影响。谱图显示α-鹅膏毒素、β-鹅膏毒素、γ-鹅膏毒素、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽在两种色谱柱上得到的分离效果和响应强度差别不大，但异绒白乳菇醛在ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱上得到的分离效果更好，响应更强，故选择ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱作为色谱柱。

本研究分别考察了水-甲醇、0.2%甲酸水-甲醇、0.5%甲酸水-甲醇、0.03%氨水-甲醇、水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈、0.5%甲酸水-乙腈、0.03%氨水-乙腈等8种流动相体系对6种蘑菇毒素分离测定的影响。谱图显示流动相体系的水相采用碱性溶剂0.03%氨水，有机相采用乙腈时，得到的6种蘑菇毒素信号响应更强，色谱峰对称无拖尾，分离效果比酸性溶剂甲酸水、中性溶剂水和甲醇更好，故选择0.03%氨水-乙腈作为流动相体系。

2.2系统性能

2.2.1最佳测定条件通过参数优化，得到6种蘑菇毒素的最佳色谱和质谱条件，见1.3。以流动相为基质，配制浓度为200µg/L的异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽的混合标准溶液，在上述最佳测定条件下实现6种蘑菇毒素的一次进样4min内基线分离，见图1。

2.2.2线性范围和敏感度分别绘制6种蘑菇毒素的工作曲线，见表2。结果表明异绒白乳菇醛在20～400μg/L的浓度范围内呈线性关系，α-鹅膏毒素、β-鹅膏毒素、γ-鹅膏毒素、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽在2～500μg/L的浓度范围内呈线性关系，相关系数均>0.999。根据1.6性能实验和计算方法得到异绒白乳菇醛的检出限为1.0μg/L，α-鹅膏毒素和γ-鹅膏毒素的检出限为0.2μg/L，β-鹅膏毒素的检出限为0.4μg/L，羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽的检出限为0.1μg/L（S/N=3）。

2.2.3回收率和精密度根据1.6性能实验和计算方法，配制高、低两个不同加标浓度的异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽标准溶液，考察方法回收率，得到6种蘑菇毒素的回收率为93.7%～101.0%。200μg/L混合标准溶液平行11次进样检测，考察方法精密度，得到相对标准偏差为0.62%～3.31%（n=11），见表3。

2.3血浆样本

2.3.1线性范围和敏感度以血浆为基质配制异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽系列混合标准溶液。根据1.4对血浆样本进行前处理，根据1.5进行样本检测。工作曲线结果显示血浆中6种蘑菇毒素在40～500μg/L的浓度范围内均呈线性关系，相关系数均>0.999。根据1.6性能实验和计算方法得到异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒素和β-鹅膏毒素的检出限为10.0μg/L，γ-鹅膏毒素、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽的检出限为6.0μg/L（S/N=3），见表4。

2.3.2回收率和精密度以血浆为基质配制成高、低两个不同加标浓度的异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽标准溶液，考察血浆样本中该方法的回收率，结果见表5。根据1.6性能实验和计算方法得到6种蘑菇毒素的回收率为90.8%～127.0%。100μg/L混合标准溶液平行11次进样考察血浆样本中该方法的精密度，得到6种蘑菇毒素的相对标准偏差为0.60%～1.90%（n=11）。

3讨论

食用毒蘑菇中毒患者大多没有毒蘑菇样本留存，因此通过鉴定毒蘑菇判断中毒的毒素种类较为困难。据报道，毒蘑菇中毒事件未能进行毒蘑菇鉴定和毒素检测的占同期毒蘑菇中毒事件数的92.59%[11]；中毒者的症状多在食用毒蘑菇后12h、甚至几天后才出现，此时大部分的毒素己进入靶器官，尿液和血液等生物样本中毒素浓度很低，仅为ng/ml数量级，极难被测出[9]。此时通过蘑菇毒素中毒患者的血浆样本第一时间确定蘑菇毒素种类，对及时救治中毒患者、降低死亡率至关重要[11-12]。

1949年，Wieland等[13]最早采用点迹法对鹅膏肽类蘑菇毒素进行测定，之后各地逐步发展出毛细管电泳法、液相色谱法等其他测定方法。近年来质谱检测技术的出现为蘑菇毒素的测定带来更高敏感度和准确度，优势明显。张秀尧等[9]采用UPLC-MS方

法实现尿液和血浆中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽等5种蘑菇毒素的同时测定，分析时间为9min，在尿液和血浆中的检出限<1μg/L。徐小民等[7]建立在线固相萃取–液相色谱–串联质谱法测定蘑菇中毒患者尿液中α-鹅膏毒肽，分析时间为11min。方力等[8]建立TurboFlow在线净化–液相色谱–三重四极杆质谱法同时测定尿液中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽等5种蘑菇毒素，分析时间为9min。上述UPLC-MS方法的前处理过程较为烦琐，对操作人员的要求较高，测定的蘑菇毒素种类也较为局限。本研究仅对血浆样本做简单前处理，以1∶3的比例加入乙腈溶液，沉淀去除蛋白，经微孔滤膜过滤后直接进样测定，大大缩短前处理分析时间。据此建立的UPLC-MS方法在4min内即可完成血浆中异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽等6种蘑菇毒素的分离测定，分析速度快，适用于蘑菇毒素中毒患者的毒素种类快速确证。与此同时，本研究首次完成血浆中异绒白乳菇醛的测定，拓宽蘑菇毒素的可检出种类。最终，采用本研究建立的UPLC-MS方法，血浆中异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒素和β-鹅膏毒素的检出限为10.0μg/L，γ-鹅膏毒素、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽的检出限为6.0μg/L，6种蘑菇毒素在40～500μg/L的浓度范围内均呈线性关系，相关系数均>0.999，敏感度高；血浆中6种蘑菇毒素的加标回收率为91.2%～127.0%，准确度高；6种蘑菇毒素的相对标准偏差为0.60%～1.90%，重现性好。

综上，本研究建立的UPLC-MS方法能快速、准确、灵敏地测定蘑菇毒素中毒患者血浆中异绒白乳菇醛、α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽的含量，不仅可为6种蘑菇毒素的快速同时确证提供技术支持，也为医疗机构准确制定中毒患者的救治措施提供科学依据，具有实际的指导意义。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024-01-02）

（修回日期：2024-03-05）