STX5对肝细胞癌转移的影响及其机制

郭婷婷 赵梓吟 何明阳 吴天松 徐斌 张斌 吴泽华 韩冰

［摘要］ 目的

探讨[STBX]STX5对肝细胞癌（HCC）转移的影响及其机制。

方法 收集2015年1—12月我院确诊为HCC的36例患者的临床资料，分析肿瘤组织中STX5表达水平与HCC患者临床病理特征的相关性。将人肝癌细胞MHCC97H分为A、B组，分别转染阴性对照质粒、过表达STX5质粒，将人肝癌细胞Huh7分为C、D组，分别转染阴性对照慢病毒、STX5敲减慢病毒，采用Western blot实验检测A～D组细胞内STX5蛋白表达水平，采用划痕实验检测A～D组细胞的迁移能力，采用Transwell实验检测A～D组细胞的迁移能力。对A、B组细胞经转录组学测序分析获得的差异基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测A、B组细胞最显著差异表达基因的水平。将MHCC97H细胞分为E～H组，分别转染阴性对照质粒、过表达STX5质粒、阴性对照质粒＋Sarilumab、过表达STX5质粒＋Sarilumab，采用划痕实验检测E～H组细胞的迁移能力，采用Transwell实验检测E～H组细胞的迁移能力。

结果 肿瘤组织中STX5表达水平与患者的BMI、有无乙型肝炎病毒感染、肿瘤数量有关（P<0.05）。Western blot检测结果显示，B组与A组、C组与D组比较，细胞中STX5的表达显著增高（t=48.86、31.09，P<0.05）。Transwell实验和划痕实验结果显示，B组与A组、C组与D组比较，细胞迁移能力和划痕愈合百分比显著升高（t=7.95～31.09，P<0.05）。GO和KEGG富集分析显示，A、B组细胞差异基因主要富集在细胞迁移、炎症等相关功能和通路上；RT-qPCR实验结果显示，B组细胞中IL-6 mRNA的表达水平显著高于A组细胞（t=23.69，P<0.05）。Transwell和划痕实验结果显示，G组和E组、H组和F组比较，细胞迁移能力和划痕愈合百分比均显著降低（t=2.94～24.39，P<0.05）。

结论 STX5可能通过上调IL-6 mRNA表达来促进肝细胞癌细胞的转移。

［关键词］ Qa-SNARE蛋白质类；白细胞介素6；癌，肝细胞；基因表达调控，肿瘤；肿瘤浸润；肿瘤转移

［中图分类号］ R735.7;R730.261    ［文献标志码］ A

目前，在全球范围内，原发性肝癌中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）约占90%，因为HCC细胞具有高侵袭性和易转移性，致患者的5年存活率较低[1]，即使近年来在肝癌的诊断和治疗方法上取得了一定的进展，但患者术后复发率和转移率仍然居高不下[2]。因此，临床迫切需要开发有效的HCC治疗靶点，以改善患者的预后，延长患者的生存期。

STX5为一种单向Ⅳ型膜蛋白，几乎在机体的所有的细胞中均有表达，是syntaxin家族的重要成员，其主要功能是作为受体，与可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子结合，在细胞内转运囊泡[3-4]。本课题组先前的研究发现，STX5可以通过介导PI3K/mTOR信号通路抑制HCC细胞的黏附，进而促进HCC转移[5]。研究表明，促炎细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等在肿瘤微环境中有助于肿瘤细胞发生免疫逃逸，促进肿瘤的进展及其转移，尤其是IL-6被认为是促进多种恶性肿瘤侵袭转移的慢性炎症细胞因子[6-8]。然而STX5促进HCC转移是否有IL-6的参与目前尚不明确。本研究拟通过探究STX5与IL-6之间的调控关系，探讨STX5对于HCC细胞转移的影响及其机制，并为进一步寻找HCC的诊断和治疗靶点奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌细胞系Huh7和MHCC97H细胞（中国上海科学院细胞库），STX5敲减慢病毒、阴性对照慢病毒、过表达STX5质粒、阴性对照质粒和病毒感染试剂（上海吉凯基因科技有限公司），STX5抗体（英国Abcam公司），GAPDH、β-actin（美国CST公司）。STX5、IL-6、PDL-1、CD36、SLC2A14、GAPDH引物（上海生工生物工程股份有限公司），全波长多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），PrimeScrip RT试剂盒（日本TaKaRa公司）以及沙利鲁单抗（美国MCE生物科技公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 肿瘤组织中STX5表达水平与HCC患者临床病理特征的相关性分析 选取我院2015年1—12月确诊为HCC行手术治疗的患者36例，术前均未进行放化疗治疗，并均签署知情同意书。收集所有患者的临床资料，包括年龄、性别、BMI、甲胎蛋白（AFP）、肿瘤直径、有无肝硬化、有无酒精史、有无乙型肝炎病毒感染以及肿瘤数量等。根据患者HCC组织中的STX5染色评分结果，将36例患者分为STX5高表达组18例（6～10分）和STX5低表达组18例（<6分）。分析肿瘤组织中STX5表达水平与HCC患者临床病理特征的相关性。

1.2.2 细胞的培养和转染 在6孔板上分别接种Huh7细胞和MHCC97H细胞，加入全营养培养基（DMEM、10%的胎牛血清和1%的青霉素/链霉素双抗），于37 ℃、含体积分数0.05的CO2的培养箱当中进行培养。当MHCC97H细胞的融合度达到70%～90%时，分为A、B两组，A组细胞转染阴性对照质粒，B组细胞转染过表达STX5质粒。当Huh7细胞的融合度达30%～50%时，分为C、D两组，C组细胞转染阴性对照慢病毒，D组细胞转染STX5敲减慢病毒。4组细胞转染完成后，继续培养48 h用于后续实验。

1.2.3 蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测细胞中STX5的相对表达量 提取转染后培养48 h的A～D组细胞中的总蛋白，并用RIPA裂解缓冲液进行分解。用BCA试剂盒和酶标记仪测定蛋白质浓度。95 ℃下孵育10 min后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白裂解产物（20SymbolmA@g），并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，用特异性一抗在4 ℃条件下孵育12 h，然后与二抗在室温下孵育约1.5 h，用增强型化学发光系统读取蛋白质条带。最后使用Image J软件分析目的条带STX5及内参β-actin灰度值，以STX5/β-actin灰度值表示相对表达水平。实验重复3次并计算均值。

1.2.4 Transwell实验检测HCC细胞的迁移能力

将转染后培养48 h的A～D组细胞中的培养基，更换为无血清DMEM培养基继续培养24 h。然后将各组5×104个细胞种植于不含血清的DMEM培养基的Transwell上室（每孔8 μm），下室为含有30%胎牛血清的DMEM，于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养24 h。用多聚甲醛将迁移到下室的细胞在室温下固定30 min，然后再用0.5%的结晶紫染色30 min，最后用PBS清洗去除多余的结晶紫。使用光学显微镜对染色细胞进行拍照，使用Image J软件对迁移细胞进行计数。

1.2.5 细胞划痕实验检测HCC细胞的迁移能力

将转染完成后培养48 h的A～D组细胞接种于6孔板中，当细胞融合率达90%以上时，采用200 μL滤芯吸头尖端在6孔板上划痕，随后，更换为含有2%胎牛血清的DMEM继续培养48 h。用电子显微镜拍摄划痕区域，分别于划痕后第0、48小时时采集图像，计算划痕愈合百分比。划痕愈合百分比=（0 h划痕宽度－48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度。

1.2.6 转录组学测序及富集分析 将转染后培养48 h的A、B组MHCC97H细胞，委托上海吉凯基因医学科技股份有限公司进行转录组学测序以及富集分析，每组设置3个样本。对两组基因表达的结果进行分析，获得两组间的差异基因（P<0.05），对差异基因进行GO功能富集分析（http：//geneontology.org）以及KEGG通路富集分析（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）。将两组的差异基因按照P值进行排序，选取前5个基因为最显著差异基因，为后续实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测的目标基因。

1.2.7 RT-qPCR检测IL-6等mRNA表达水平

将转染后培养48 h的A、B组MHCC97H细胞，用RNA-easy分离试剂提取全细胞RNA后，使用紫外分光光度计测定260、280 nm波长处的RNA样本浓度以及吸光度（A）值，将RNA质量在1.8

1.2.8 MHCC97H细胞回复实验检测抑制剂处理后HCC细胞的迁移能力 取融合度达70%～90%的MHCC97H细胞，分为E～H组，E组和G组细胞分别转染阴性对照质粒，F组和H组细胞分别转染过表达STX5质粒，转染成功以后均再继续培养48 h后，G组和H组细胞弃去原培养基，加入IL-6的抑制剂沙利鲁单抗6 μmol，再培养24 h；E组和F组细胞，弃去原培养液后，再培养24 h。通过Transwell迁移实验检测各组细胞的迁移细胞数量（参照1.2.4中的方法），通过划痕实验观察各组细胞划痕后第0、48小时时划痕愈合情况，并计算划痕愈合百分比（参照1.2.5中的方法）。

1.3 统计学处理

使用SPSS 23.0软件进行数据的统计分析。计量数据以[AKx-D]±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例表示，两组之间的比较用确切概率法，STX5在肿瘤组织中的表达水平与HCC患者的临床病理特征之间的关系使用Pearson方法分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 肿瘤组织中STX5表达水平与HCC患者临床病理特征的相关性

肿瘤组织中STX5表达水平与患者的性别、年龄及肿瘤直径、血液AFP水平、有无肝硬化、有无饮酒史等指标均无关（P＞0.05），而与患者BMI、有无乙型肝炎病毒感染以及肿瘤数量等显著相关（P<0.05）。见表2。

2.2 A～D组细胞迁移侵袭能力的比较

Western blot检测的结果显示，A、B组MHCC97H细胞中STX5相对表达量分别为1.00±0.00、3.60±0.09，两组间比较差异有显著意义（t=48.86，P<0.05）；C、D组Huh7细胞中STX5相对表达量分别为1.00±0.00、0.11±0.03，两组间比较差异有显著性（t=31.09，P<0.05），见图1。Transwell实验检测结果显示，A、B组细胞迁移数目分别为（101.00±2.65）、（234.00±10.15）个，两组比较差异有显著性（t=21.96，P<0.05）；C、D组细胞迁移数目分别为（482.70±18.61）、（141.00±4.00）个，两组比较差异有显著性（t=31.09，P<0.05），见图2。划痕实验检测的结果显示，A、B组细胞的划痕愈合百分比分别达到（29.03±1.76）%、（47.07±3.51）%，两组比较差异具有显著意义（t=7.95，P<0.05）；C、D组细胞划痕愈合百分比分别为（44.37±1.70）%、（27.07±2.80）%，两组比较差异有显著性（t=9.13，P<0.05），见图3。

2.3 A、B组MHCC97H细胞差异基因分析和检测

转录组学测序结果显示，A组与B组中的差异基因共387个，其中196个差异基因上调，191个差异基因下调。GO功能富集分析结果显示，差异基因显著参与了炎症的调控、细胞黏附等生物学功能。KEGG通路富集分析结果显示，差异基因主要参与mTOR、JAK-STAT等通路的调控。对差异最显著的前5个基因进行RT-qPCR检测，结果显示，A组和B组细胞中STX5、IL-6 mRNA相对表达量比较差异具有显著性（t=24.38、23.69，P<0.05），两组间PDL-1、CD36、SLC2A14 mRNA相对表达量比较差异无显著性（P＞0.05）。见表3。

2.4 MHCC97H细胞的回复实验结果

划痕实验检测的结果显示，E、G组细胞的划痕愈合百分比分别达到（32.00±2.00）%、（25.00±3.61）%，两组比较差异具有显著意义（t=2.94，P<0.05）；F组和H组划痕愈合百分比分别为（45.33±2.08）%、（35.67±3.22）%，两组比较差异有显著性（t=4.37，P<0.05），见图4。Transwell实验结果显示，E、G组细胞迁移数目分别为（186.00±6.00）、（102.70±2.52）个，两组比较差异具有显著意义（t=22.18，P<0.05）；F组和H组细胞迁移数目分别为（453.30±14.19）、（235.00±6.25）个，两组比较差异有显著性（t=24.39，P<0.05），见图5。

3 讨  论

目前，肝癌常见的治疗方法主要包括手术切除、消融、肝移植、TACE、放化疗、免疫疗法、中药治疗等，但患者的长期存活率仍不理想。主要原因是由于肝细胞癌患者术后的高复发率和高转移率[9]。因此，降低患者术后的复发和转移，探索导致肝细胞癌复发转移的治疗靶点具有重要的临床和社会意义。

STX5主要调控真核细胞中的分泌蛋白从内质网到高尔基体的早期运输。内质网中有着严格的质量控制系统，新蛋白质往往在内质网中合成加工，形成具有一定空间功能的蛋白质[10]；而STX5的功能主要是保证蛋白分子正确折叠并且离开内质网输送到高尔基体，防止蛋白质功能的异常或失活[11]，而肿瘤主要发病机制多是由于一些促癌分子或抑癌分子的错误折叠和异常转运，致功能异常所致[12]。由mTOR通路降低肝癌细胞与细胞外基质之间的黏附，致肝癌细胞从原发部位脱落，从而促进了肿瘤细胞的转移[5]。进一步提示STX5可能作为促癌基因参与了肿瘤的侵袭和转移过程。

本研究首先收集了我院HCC患者的临床病理组织标本，对肿瘤组织STX5的表达水平与患者的临床病理特征进行了相关性分析，结果显示肿瘤组织中STX5的表达水平与患者的BMI、有无乙型肝炎病毒感染和肿瘤数量显著相关，提示STX5在HCC的发生和进展中可能发挥着重要作用。本研究通过在MHCC97H细胞中构建STX5过表达质粒，在Huh7细胞中构建敲减STX5慢病毒，并用Western blot实验验证其转染效率，结果显示B组细胞中STX5的蛋白表达显著高于A组细胞，D组细胞中STX5蛋白表达量显著低于C组。然后本研究又进一步探究STX5对HCC细胞迁移的影响，结果显示，上调STX5后，B组细胞比A组细胞的迁移能力明显增强，下调STX5后，D组细胞比C组细胞的迁移能力明显减弱，进一步提示STX5可促进HCC细胞的转移。

为了探讨STX5调控HCC细胞转移的机制，通过转录组学测序，本研究GO功能富集分析发现，A组和B组细胞的差异基因显著参与了炎症的调控、细胞黏附等生物学功能，提示STX5可能通过影响炎症的调控，进一步影响HCC的进展。通过KEGG通路富集分析发现，A组和B组细胞的差异基因主要参与mTOR、JAK-STAT等通路的调控，提示STX5可能通过影响PI3K/mTOR等炎症相关通路促进HCC的转移。慢性炎症已被公认为是引起肿瘤侵袭转移的重要原因之一[10]，而其中的细胞因子是肿瘤微环境（TME）的主要调节者，是癌细胞、肿瘤间质和免疫系统之间的主要沟通桥梁[13-14]。研究发现，PI3K/mTOR通路不仅参与调节癌细胞的增殖、生长、代谢和运动[15-16]，还参与了炎症因子IL-6的调控。因此，对炎症因子的调控可以作为肿瘤治疗的有效介入策略。本研究结果显示，STX5与炎症调控相关，并可能通过这一途径促进HCC的转移。

本研究对转录组测序获得的前5个最为显著的差异基因进行RT-qPCR检测，结果显示B组细胞中STX5、IL-6 mRNA的表达水平显著高于A组细胞，而两组间PDL-1、CD36、SLC2A14 mRNA的表达水平比较无显著差异，提示STX5可能参与了调控IL-6 mRNA的表达。IL-6及其相关细胞因子被认为是炎症和肿瘤之间的关键因子[17]。IL-6家族包含多个成员：IL-6、抑癌素M（OSM）、白血病抑制因子（LIF）、IL-11、IL-27以及IL-31等[18]。大多数IL-6家族的细胞因子与肿瘤患者的不良预后显著相关[19-20]。肿瘤的进展、转移和抗药性的关键环节是上皮间质转化（EMT），IL-6可以通过激活STAT3和Snail等转录因子来促进EMT，进一步推动肿瘤的转移[19]。为了进一步研究STX5是否通过调控IL-6的mRNA水平促进HCC的转移，本研究通过对G、H组细胞经沙利鲁单抗处理，E、F组细胞不处理，进行回复实验，结果显示，加入抑制剂后，G组细胞比E组细胞的迁移能力明显减弱，H组细胞比F组细胞的迁移能力明显减弱。本课题组先前的研究也表明，STX5促进HCC转移的作用与促进EMT是密切相关的[5]。结合本研究的结果，提示STX5可能是通过上调IL-6的mRNA水平促进EMT，并进一步促进HCC细胞的转移。

综上所述，STX5具有促进HCC转移的作用，其机制不仅与EMT和PI3K/mTOR通路相关，还与上调IL-6 mRNA的水平密切相关。未来应进一步探究STX5、IL-6与肿瘤微环境之间调控的具体机制，为HCC的治疗提供新思路。

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准（文件号QYFYWZLL26906）。所有试验过程均遵照《赫尔辛基宣言（1996版）》和中国有关临床试验研究规范法规进行。受试对象及其亲属已经签署知情同意书。

［参考文献］

[1]LI X， RAMADORI P， PFISTER D， et al. The immunological and metabolic landscape in primary and metastatic liver cancer[J]. Nat Rev Cancer， 2021，21（9）：541-557.