?一株硝化纤维素降解菌的筛选及其降解机制初探?

2024-06-30刘强林元山粟桂蓉周喜新

湖南农业科学 2024年5期

刘强　林元山　粟桂蓉　周喜新

摘要：以硝化纤维素为筛选培养基，对采样分离所得菌株和实验室保藏菌株进行平板筛选，获得长势优良的6株降解菌；经固态发酵复筛，获得硝化纤维素降解菌TL06；经ITS序列分析及构建进化树分析，TL06被鉴定为西蒙斯木霉，且命名为西蒙斯木霉TL06。分别探究培养基成分、培养条件对西蒙斯木霉TL06产生纤维素酶和酯酶活力的影响，结果表明：培养基中添加有机氮源会显著降低纤维素酶和酯酶活力，而添加无机氮源硫酸铵会显著提高纤维素酶活力；添加碳源会显著降低纤维素酶活力，但对酯酶活力影响不明显。为优化发酵条件设置正交试验，发现在硫酸铵浓度1.5%、硝化纤维素与麸皮的质量比5∶5、发酵时间5 d、料水比10∶12、培养温度30℃、自然pH值条件下，纤维素酶活力达到1.36 IU/g，比优化前提高了189.36%。初步探明，西蒙斯木霉TL06降解硝化纤维素的机制是分泌纤维素酶和酯酶，水解β-1，4糖苷键和硝酸酯键，其中糖苷键的水解优先启动。

关键词：硝化纤维素；生物降解；纤维素酶；酯酶；西蒙斯木霉

中图分类号：TQ560.1文献标识码：A文章编号：1006-060X（2024）05-0001-06

Screening of Nitrocellulose Degrading Strain and Preliminary Study on Its Degradation Mechanism

LIU Qiang，LIN Yuan-shan，SU Gui-rong，ZHOU Xi-xin

（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： Nitrocellulose was used as a screening medium， and six degrading strains with excellent growth were obtained by plate screening of the isolated strains after sampling and the strains stored in the laboratory. The nitrocellulose degrading strain TL06 was obtained by solid state fermentation and secondary screening. Through ITS sequence analysis and phylogenetic tree analysis， it was identified as Trichoderma simmonsii and named Trichoderma simmonsii TL06. The effects of medium components and culture conditions on cellulase and esterase activities of Trichoderma simmonsii TL06 were investigated. The results showed that the cellulase and esterase activities were significantly decreased by adding an organic nitrogen source into the medium， while the cellulase activity was significantly increased by adding an inorganic nitrogen source ammonium sulfate. Adding a carbon source significantly reduced cellulase activity but had no significant effect on esterase activity. In order to optimize the fermentation conditions， the orthogonal experiment was set up. It was found that the cellulase activity reached 1.36 IU/g under the conditions of ammonium sulfate concentration of 1.5%， mass ratio of nitrocellulose to bran of 5：5， fermentation time of 5 d， feed-to-water ratio of 10∶12， culture temperature of 30℃， and natural pH value， which was 189.36% higher than that before optimization. It was preliminarily discovered that the mechanism of Trichoderma simmonsii TL06 in degrading nitrocellulose was the secretion of cellulase and esterase and the hydrolysis of β-1，4 glucoside bond and nitrate bond， in which the hydrolysis of glucoside bond was preferentially initiated.

Key words： nitrocellulose; biodegradation; cellulase; esterase; Trichoderma simmonsii

硝化纤维素（Nitrocellulose）又名硝化棉、棉体火棉胶等，属于硝酸酯类，是纤维素与硝酸酯化反应的产物，遇明火、高热极易燃烧爆炸，危害极大[1]。硝化纤维素的化学结构式中长链以β-1，4糖苷键连接，该键能量低，不活跃，结构稳定，温和条件下难以断裂。此外，硝化纤维素中大量硝酸酯键之间的空间位阻较大，酯酶的催化中心难以达到该区域进行水解。

双基火药是退役报废弹药的主要产物，主要成分为硝化纤维素和硝化甘油，还含有较少的二苯胺、吉纳、樟脑、铝粉、鞣酸铅等物质[2]。退役报废弹药的处理方式经历了深土掩埋、深海倾倒、粗放焚烧到机械化拆卸、切割及倒空，再到融合智能化、自动化及经济环保化的发展阶段[3]。对于不能回收再利用的报废双基火药，目前采用的处理方式主要是焚烧。然而，焚烧往往会导致二次危害和污染。近年来，利用微生物降解退役报废双基火药成为绿色发展的新方向[4-5]。该研究旨在筛选硝化纤维素的降解菌，探索微生物法断裂硝化纤维素中的β-1，4糖苷键和硝酸酯键的环境友好型方案，以实现退役报废双基火药的无害化、资源化、肥料化利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂大颗粒双基火药由国内某单位提供，其硝化纤维素含量为94%～96%；乙酸对硝基苯酯CAS 830-03-5购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备 SX500灭菌锅（日本TOMY公司），ZS-BRM培养箱（浙江华源仪器有限公司），HSX-250智能恒温恒湿箱（上海福玛实验设备公司），U2000分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司），CR21G离心机（日本HITACHI公司），荣事达1000型密闭超细粉碎机（合肥荣事达电子电器集团有限公司），FLIR TG165红外成像测温仪（美国菲力尔公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制（1）筛选培养基：硝化纤维素粉4 g，琼脂2 g，蛋白胨0.1 g，自来水100 mL，121℃灭菌20 min。（2）斜面培养基：20%马铃薯汁100 mL，琼脂2 g，加热溶解并分装，每支试管5 mL制作斜面，121℃灭菌20 min。（3）固态发酵培养基：麸皮5 g，硝化纤维素粉5 g，自来水12 mL，于250 mL锥形瓶中搅拌均匀，封口膜封瓶口，121℃灭菌20 min。

1.2.2 硝化纤维素粉的制备将水中储存的大颗粒双基火药自然阴干，取10 g用自封袋密封，置于-80℃的冰箱完全预冻。之后迅速转至不锈钢密闭粉碎机中，高速粉碎1 min，停歇1～3 min，循环6～8次。用红外成像测温仪远距离测定粉碎机壳体温度，确保粉碎机温度不超过50℃，控制粉碎机开关操作人员与粉碎机保持10 m以上安全距离，确保粉碎操作安全，双基火药粉碎前后的形态见图1。

1.2.3 菌株的筛选（1）样品采取：选取腐烂的水稻秸秆，干燥后研磨至细小粉末备用。（2）菌株初筛：将筛选培养基从灭菌箱取出，趁热摇匀倒平板，待其冷却凝固；称取5 g研磨后的腐烂秸秆粉，投入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，于转速200 r/min的摇床中振荡30～60 min，然后稀释至10-7；在10-4～10-7稀释液中，分别取0.1 mL涂布平板，每个梯度涂布4～6个平皿，于30℃恒温培养箱中倒置培养2～4 d，每天观察菌落形态变化，选取长势良好的菌落接种至试管斜面，于30℃恒温培养箱继续培养至斜面长出菌落，置于4℃冰箱备用。（3）固态发酵复筛：将初筛斜面接种至发酵培养基，于30℃恒温培养箱中静置培养2～7 d，观察麸曲中菌体生长状态，并在菌体长至稳定期时终止发酵，加入蒸馏水100 mL，搅匀，在室温条件下于摇床中振荡浸提30 min，取上清液，用于纤维素酶与酯酶活力及还原糖、亚硝酸根和硝酸根含量的测定，通过形态观察，感官评价菌株生物量，从而选取最优的硝化纤维素降解菌。

1.2.4 纤维素酶和酯酶的提取将干重为10 g的固体发酵曲，用100 mL蒸馏水浸提30 min，200目无纺布过滤，发酵液滤液在转速10 000 r/min下离心6 min，上清液即为粗酶液，用于测定纤维素酶和酯酶活力。

1.2.5 纤维素酶滤纸酶活力的测定配制不同浓度的葡萄糖溶液，加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸溶液，在沸水浴中加热反应5 min，取出冷却至室温。于540 nm波长下测定吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，测定还原糖含量[6]。葡萄糖标准曲线为：y=6.87x+0.0025，其中，x为吸光度，y为葡萄糖含量。在50℃、pH值5.0条件下，定义1 mL粗酶液1 min水解新华滤纸（1 cm×6 cm）生成1 ?mol葡萄糖所需的酶量，为1个活力单位（IU）。空白组处理为粗酶液中加入0.5 mol/L氢氧化钠溶液1.0 mL灭酶活。酶活力（Y）按公式（1）计算。

式中：y为还原糖含量（?mol），n为发酵曲的浸提液体积（mL），t为酶液与底物的反应时间（min），M为发酵曲培养基干重（g）。

1.2.6 酯酶活力的测定配制不同浓度的对硝基苯酚溶液，拟合对硝基苯酚标准曲线，测定酯酶活力。以乙酸对硝基苯酯（p-NPA）为底物，在20 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.8）中加入0.1 mL酶溶液和1 mL 浓度为5 mmol/L的p-NPA，在30 ℃下反应5 min，反应液定容至10 mL。在400 nm波长处测定吸光度，绘制对硝基苯酚标准曲线，计算对硝基苯酚的含量，由此进行酯酶活力测定[7]。标准曲线为：y=2.24x+0.0033，其中，x为吸光度，y为硝基苯酚浓度。一定条件下，定义1 min释放1 ?mol对硝基苯酚所需的酶量为一个活力单位（IU）。酶活性（Y）按公式（2）计算。

式中：y为硝基苯酚含量（?mol），n为发酵曲的浸提液体积（mL），10为粗酶液稀释倍数；t为酶液与底物反应时间（min），M为发酵曲培养基干重（g）。

1.2.7 亚硝酸根含量的测定根据标准GB5009.33

—2016测定亚硝酸根的含量。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。

1.2.8 硝酸根含量的测定根据标准GB/T35496—2017测定硝酸根的含量。在硫酸介质中，靛蓝二磺酸钠（靛蓝胭脂红）被硝酸盐氧化成黄色的靛崧，从而使靛蓝消失，采用分光光度法在620 nm波长处测定其含量。

1.2.9 菌株鉴定将产纤维素酶和酯酶性能优势的菌株寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司成都测序部进行分子鉴定，与基因库数据比对，构建进化树，确定菌株种属。

1.2.10 硝化纤维素降解条件的优化在发酵培养基初始条件下，以不同硫酸铵浓度、硝化纤维素与麸皮配比、发酵时间对产纤维素酶和酯酶的影响进行正交试验，优化硝化纤维素降解的条件。重复3次，取平均值，利用SPSS 20软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 硝化纤维素降解菌的筛选

以硝化纤维素为筛选平板的唯一碳源，对多次采样分离所得的菌株以及实验室保藏菌株进行平板筛选。结果表明，硝化纤维素培养基上生长的菌株总体较少，大多为丝状真菌，细菌较少，酵母类真菌难以生长，部分筛选平板如图2所示。生长情况较好的有：实验室保藏菌株青霉Lys-4、棘孢曲霉GPG-75、黑曲霉Lys2280，新筛选菌株TL06、Lyz217、Lyz318。筛选平板中，菌丝长势由优到劣依次是菌株TL06、青霉Lys-4、Lyz217、Lyz318、棘孢曲霉GPG-75和黑曲霉Lys2280。菌丝长势表征生物量，反映菌株对筛选培养基的利用程度。硝化纤维素的元素组成包含了碳、氢、氧、氮，其连接键主要为糖苷键和硝酸酯键，生物对硝化纤维素的利用从水解糖苷键和硝酸酯键开始。可见，对糖苷键和硝酸酯键的水解酶的产生菌进行筛选，可优选出硝化纤维素降解菌株。

2.2 硝化纤维素降解菌的纤维素酶与酯酶活力及降解分析

将从硝化纤维素平板中筛选得到的长势优良的6株菌株，接种至发酵固体培养基中进行复筛，菌丝铺满培养基后测定其纤维素酶和酯酶活力，结果见表1。

从表1可知，不同菌株的生长和发酵周期差异明显，棘孢曲霉GPG-75、黑曲霉Lys2280生长最快，发酵3 d后发酵曲完全变黑；其次是青霉Lys-4，3.5 d后发酵曲发白泛绿；再次是菌株TL06，4 d后发酵曲完全变绿；而菌株Lyz217、菌株Lyz318生长缓慢，直到培养6 d后发酵曲才铺满白色菌丝。从菌丝生物量看，青霉Lys-4的菌丝最发达，发酵持续时间长，期间菌丝渗透、包裹整个发酵曲，发酵曲蓬松发白，可见青霉Lys-4菌丝对培养基利用最好。菌株TL06对培养基的利用仅次于青霉Lys-4，菌丝前期蓬松发白，后期变绿。菌株Lyz217和菌株Lyz318虽然生长缓慢，但后期菌丝丰满，培养基的利用程度很好。棘孢曲霉GPG-75和黑曲霉Lys2280虽然生长很快，但过早进入形态分化期，产生大量黑褐色孢子，说明培养基利用不足。

由于培养基的固形物中，硝化纤维素和麸皮占比均为50%，菌丝生长良好不一定是充分利用硝化纤维素的结果，也有可能是利用麸皮的结果。因此，检测发酵曲中纤维素酶和酯酶活力，以检验菌株对硝化纤维素的糖苷键和酯键的水解能力。表1显示，纤维素酶活力以菌株Lyz318最优，活力达到0.93 IU/g，与其他菌株产生的纤维素酶活力差异显著（P＜0.05，下同）；其次是菌株TL06、青霉Lys-4和棘孢曲霉GPG-75。酯酶活力以菌株TL06最优，活力达到1.95 IU/g，其次是棘孢曲霉GPG-75和青霉Lys-4。从发酵曲中游离的亚硝酸根离子浓度来看，菌株TL06游离的最多，达120.73 μg/g，其次是菌株Lyz217。考虑到硝化纤维素由大量糖苷键和硝酸酯键组成，若选择单一降解菌，总体降解效果菌株TL06最优；若是选择复合菌，可以考虑将菌株TL06和菌株Lyz318混菌发酵，但其工艺有待进一步优化。

2.3 硝化纤维素降解菌的鉴定

对固态发酵复筛的优良菌株TL06进行形态观察，并进行ITS测序，所获序列与GenBank数据库进行比对，构建进化树。进行Blast同源性比较得出，菌株TL06与菌株Trichoderma simmonsii CBS 130431同源性最高，因此菌株TL06鉴定为西蒙斯木霉（Trichoderma simmonsii），命名为西蒙斯木霉TL06，基因库登录号为SUB13859491，构建的进化树见图3。西蒙斯木霉TL06，菌丝初期呈白色，后逐步产生浅绿色孢子和墨绿色孢子；菌丝有隔膜，向上伸出直立的分生孢子梗；在22～36℃能够较好生长，最适温度为28～30℃；西蒙斯木霉TL06在pH值3.0～7.0都能生长，最适pH值为4.5～6.0。

2.4 培养基成分对西蒙斯木霉TL06产生纤维素酶与酯酶活力的影响

硝化纤维素中富含糖苷键和硝酸酯键，培养基中硝化纤维素含量和含水量直接影响西蒙斯木霉TL06对硝化纤维素的利用程度。表2显示，硝化纤维素与麸皮的质量比为5∶5，料水比为10∶12时，其纤维素酶和酯酶活力相对最优，且显著优于其他配比。

在固态发酵培养基上，研究碳源、氮源对西蒙斯木霉TL06产生的纤维素酶与酯酶活力的影响。从表3可知，培养基成分中添加酵母膏、黄豆粕、玉米浆、蛋白胨等有机氮源，会显著降低纤维素酶和酯酶活力；添加无机氮源硫酸铵显著提高纤维素酶活力，达到1.04 IU/g，但酯酶活力有所减小。在基础培养基条件下，进一步探究单一无机氮源硫酸铵对纤维素酶与酯酶活力的影响。表3显示，硫酸铵浓度为1.5%时，西蒙斯木霉TL06的纤维素酶活力显著提高，达到1.12 IU/g。除此之外，发酵曲形态分化差异明显，添加硫酸铵还能延长菌丝繁殖时间，发酵曲的绿色孢子分化缓慢，菌丝产酶时间长，这与秸秆“氨化”的降解作用一致。

由表4可知，与固态发酵培养基相比，培养基中添加碳源时，会显著降低西蒙斯木霉TL06的纤维素酶活力。当环境中有快速可利用的碳源时，西蒙斯木霉TL06无需分泌纤维素酶水解复杂碳源，而是直接吸收利用环境中速效碳源。另外，碳源的添加对酯酶活力影响不明显。

2.5 培养条件对西蒙斯木霉TL06的纤维素酶与酯酶活力影响

西蒙斯木霉TL06对硝化纤维素的降解会受环境条件影响，因此，试验探究了温度、发酵时间和环境pH值对其产生纤维素酶和酯酶的影响。从表5可知，西蒙斯木霉TL06在pH值为4.0～7.0时能很好的生长，其纤维素酶活力在pH值5.0～6.5范围内无显著差异。但酯酶活力受pH值影响显著，最适pH值为5.5，此时酯酶活力达2.09 IU/g。由于硝化纤维素与麸皮配制的培养基，pH值范围处于5.2～5.8范围，因此无需调配pH值，西蒙斯木霉TL06就可以很好的生长。此外，西蒙斯木霉TL06产纤维素酶的最适温度为28～32℃，产酯酶的最适温度为30℃；产纤维素酶的最适发酵时间为4～5 d，产酯酶的最适发酵时间为5 d，纤维素酶活力优先于酯酶达到峰值，推测西蒙斯木霉TL06优先降解硝化纤维素的糖苷键。

2.6 西蒙斯木霉TL06产生纤维素酶的正交试验分析

从单因素试验结果来看，西蒙斯木霉TL06与其他木霉属菌株，如绿色木霉、康氏木霉相比，能产生具有较高活力的纤维素酶，对降解硝化纤维素的主链起到关键作用。因此，试验选择硫酸铵浓度（A）、硝化纤维素与麸皮配比（B）、发酵时间（C）作为考察因素，其中，硫酸铵浓度分别设置为1%（I）、1.5%（II）、2%（III），硝化纤维素与麸皮配比分别设置为4∶6（I）、5∶5（II）、6∶4（III），发酵时间分别设置为4 d（I）、4.5 d（II）、5 d（III），进行3因素3水平的正交试验，试验设计及结果见表6。极差分析表明，3个因素对西蒙斯木霉TL06产纤维素酶的影响程度排序为硝化纤维素与麸皮的质量比＞发酵时间＞硫酸铵浓度。根据K值判断，最佳组合为A2B2C3，即硫酸铵浓度为1.5%、硝化纤维素与麸皮的质量比为5∶5、发酵时间5 d为最佳方案。该组合方案下设置料水比10∶12，培养温度30℃，培养基起始pH值为自然pH值，纤维素酶活力达到1.36 IU/g，比优化前（0.47 IU/g）提高了189.36%。

3 讨论与结论

退役报废双基火药的一些成分会抑制生物细胞生长，这大大增加了其生物降解的难度。硝化纤维素是退役报废双基火药的主要成分，糖苷键连接其主链，硝酸酯键连接侧链基团。要将大分子硝化纤维素降解为小分子，主链降解必不可少，而要实现硝化纤维素的充分降解，侧链水解也极其重要。由此可见，退役报废双基火药的无害化、资源化、肥料化利用，要充分发挥糖苷键水解酶和酯键水解酶的作用。目前，报废弹药的主要销毁方式仍然是物理拆卸、焚烧、爆炸等方法，其操作安全和环境污染等问题难以克服[8-9]。因此，根据硝化纤维素富含β-1，4糖苷键和硝酸酯键的特点，该研究设计了生物酶水解这2种化学键的试验方案，获得能利用硝化纤维素的西蒙斯木霉TL06。西蒙斯木霉TL06降解硝化纤维素的机制是分泌纤维素酶和酯酶水解β-1，4糖苷键和硝酸酯键，纤维素酶和酯酶活力分别达0.47和1.95 IU/g，其中糖苷键的水解启动先于酯键的水解。研究中纤维素酶的活性测定使用的是滤纸纤维素，不溶于水，是纤维素酶作用的真实底物；酯酶活力测定则使用乙酸对硝基苯酯，溶解性好，是酯类的类似底物，间接反映酯酶活力，由于测定分析方法选用的酶解底物不同，相关酶活性数据上产生的差异较大[10]。

培养基中的成分会影响西蒙斯木霉TL06对硝化纤维素的利用程度。在固态发酵培养基中添加有机氮源，会显著降低纤维素酶和酯酶活力；添加无机氮源硫酸铵则能显著提高纤维素酶活力，但酯酶活力有所减小。培养基中添加碳源时，会显著降低纤维素酶活力，但对酯酶活力影响不明显。此外，西蒙斯木霉TL06对硝化纤维素的降解程度还会受到温度、发酵时间和环境pH值的影响。设计正交试验发现，西蒙斯木霉TL06在硫酸铵浓度1.5%、硝化纤维素与麸皮的质量比5∶5、发酵时间5 d、料水比10∶12，培养温度30℃和自然pH值条件下，纤维素酶活力达到1.36 IU/g，比优化前提高了189.36%。该研究为硝化纤维素的微生物降解提供了参考方案，为报废退役双基火药的无害化、资源化、肥料化利用提供了方向。

参考文献：

[1] 赵海平，刘天生，刘登程. 微米级硝化纤维素的制备及性能研究[J]. 火炸药学报，2017，40（2）：65-68.

[2] 吴浩然. 改性双基推进剂辐射点火与燃烧特性研究[D]. 南京：南京理工大学，2021.

[3] 史明明，万丽强，陆鹏，等. 国内外报废弹药处理技术发展现状[J]. 火工品，2022（3）：75-80.

[4] 杨士山，张伟，王吉贵. 硝化甘油和硝化棉的微生物降解研究进展[J]. 化工进展，2011，30（8）：1854-1857.

[5] 黄娟，薛会会，张阿磊，等. 高大毛壳对硝化纤维素的降氮机理[J]. 兵工学报，2024，45（3）：875-884.

[6] GHOSE T K. Measurement of cellulase activities[J]. Pure and Applied Chemistry，1987，59（2）：257-268.

[7] YAO J，GUI L，YIN S C. A novel esterase from a soil metagenomic library displaying a broad substrate range[J]. AMB Express，2021，11（1）：38.

[8] 周赢，姜林，李宓，等. 含聚四氟乙烯铝热剂销毁薄壁弹药的试验研究[J]. 工程爆破，2024，30（2）：110-116.

[9] 孟欢，朱勇兵，王晴，等. 吉林某弹药销毁场土壤炸药污染调查及其赋存状态研究[J]. 中国无机分析化学，2022，12（3）：31-39.

[10] 林元山. 康氏木霉AS3.2774纤维素酶系的诱导、阻遏、纯化及鉴定研究[D]. 南宁：广西大学，2011.

（责任编辑：王婷）