北部湾植物内生真菌的分离及次级代谢产物鉴定

王诗怡 王玉妃 刘江晔 刘硕 李子林 刘金燕 孔凡栋 王聪

摘要：目的 对北部湾3株药用植物的内生真菌进行研究，研究小叶海金沙内生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573次级代谢产物。方法 通过10倍稀释法分离小叶海金沙、野牡丹和莲子草的内生真菌，对小叶海金沙内生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573的次级代谢产物进行分离纯化，通过NMR、MS、ECD等方法进行结构鉴定，采用DPPH法进行化合物抗氧化活性检测，采用微量二倍稀释法进行抑菌活性测试。结果 从3株植物中分离到内生真菌171株，从Spegazzinia sp. MDCW-573的次级代谢产物中共分离得到异香豆素类化合物3个，其中化合物1为新化合物。化合物1对金黄色葡萄球菌及MRSA、化合物3对MRSA的抑菌活性MIC均为128 μg/mL。结论 化合物1～3都是首次从斯氏霉属真菌的次级代谢产物分离获得，化合物1是1个新化合物，化合物1和3具有抑菌活性。

关键词：广西北部湾；内生真菌；Spegazzinia sp.；次级代谢产物

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Isolation and secondary metabolites identification of endophytic fungi from plants in the Beibu Gulf

Wang Shiyi， Wang Yufei， Liu Jiangye， Liu Shuo， Li Zilin， Liu Jinyan， Kong Fandong， and Wang Cong

（Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， State Ethnic Affairs Commission， Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products， Key Laboratory of universities in Guangxi for Excavation and Development of Ancient Ethnomedicinal Recipes，

Guangxi Minzu University， Nanning 530006）

Abstract Objective The endophytic fungi of three medicinal plants in the Beibu Gulf were studied， and the secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573 from Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br. were also investigated. Methods The endophytic fungi Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br.， Melastoma candidum D. Don and Alternanthera sessilis （L.） R. Br. ex DC. were isolated by the ten-fold dilution method. The secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573 from Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br. were isolated and purified. The structures were identified by NMR， MS and ECD methods. The antioxidant activity of the compounds was detected by the DPPH method， and the antibacterial activity was tested by the micro-double dilution method. Results A total of 171 strains of endophytic fungi were isolated from these three plants. Three isocoumarin compounds were isolated from the secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573， among which compound 1 was a new compound. Compounds 1 and 3 displayed antibacterial activitiesagainst MRSA with the same MIC value of 128 μg/mL. The MIC of compound 1 against Staphylococcus aureus was 128 μg/mL. Conclusion Compounds 1～3 were isolated from the secondary metabolites of Spegazzinia sp. for the first time. Compound 1 is a new compound， and compounds 1 and 3 showed antibacterial activity.

Key words Beibu Gulf of Guangxi; Endophytic fungi; Spegazzinia sp.; Secondary metabolites

内生真菌（endophyte）是一类生长在宿主植物体中而不引起明显病害现象的共生微生物。内生真菌与宿主在长期协同进化的过程中互惠共生[1-2]，宿主为内生真菌提供营养物质，内生真菌产生生物活性物质使得宿主免受生物和非生物胁迫的影响，增强宿主在生存竞争中的优势[3-5]。目前所知研究已报道的内生真菌次级代谢产物有酚类、醌类、萜类、生物碱、类固醇、黄酮类、香豆素类[6]， 具有抗癌[7]、免疫调节[8]、抗炎[9]、抗菌[10]、抗结核[11]、抗糖尿病[12]、驱虫[13]等诸多有益生物活性。此外，还有研究证明内生真菌可以与宿主植物产生相似的代谢物如类黄酮、皂苷、酚酸、萜烯等被认为是结构新颖、活性独特化合物的重要来源[14]。

北部湾地处热带和亚热带，药用植物资源丰富。苏秀丽等[15]在黄花倒水莲的1株链格孢属HNLF-44内生真菌发酵液中发现黄酮类物质，DPPH清除率在80%以上，具有较强的清除活性。Luo等[16]在广西地不容块根的一株橘青霉DBR-9内生真菌的发酵物中鉴定出2种活性聚酮类化合物，对于病原真菌具有较强抑制作用。宋静静等[17]发现夹竹桃的内生真菌次级代谢产物具有抑制水产病原菌生长的作用。龚斌

等[18]发现广西柳树桑寄生的1株拟盘多毛孢属内生真菌次级代谢产物对A549和H460具有较强抑制作用。

本研究选取小叶海金沙[Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br.]、野牡丹[Melastoma candidum D. Don]和莲子草[Alternanthera sessilis （L.） R. Br. ex DC.] 3种广西药用植物为研究对象。小叶海金沙药用成分包括黄酮类、酚酸及酚苷类、甾类、萜类、挥发油等，具有抑菌及抗氧化降血糖等药理作用[19]。野牡丹药用成分包括甾体、黄酮、有机酸、萜类、酰胺类、氨基酸、酯类等，具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等药理活性[20]。莲子草药用成分包括黄酮类、萜类、甾醇类、有机酸类、氨基酸类、生物碱、酰胺等，具有抗病毒、免疫调节、抗肝炎、抑菌等药理作用[21]。通过10倍稀释法对3种药用植物样品进行真菌分离，使用两种培养基对获得的菌株进行发酵。通过菌株形态排重结合化学排重（HPLC、TLC）共获得171株真菌。从中选取小叶海金沙的内生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573为目标菌株，其次级代谢产物经分离鉴定后得到3个异香豆素类化合物，化合物1是新化合物，抑菌和抗氧化活性测试表明化合物1与化合物3有抑菌活性，化合物2抑菌活性不显著，3个化合物均未表现出显著的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

小叶海金沙、野牡丹和莲子草均采自广西北部湾，小叶海金沙（21°54′16′′，108°36′49′′）、野牡丹（21°54′14′′，108°36′48′′）、莲子草（21°54′5′′，108°36′50′′）。

1.1.2 分离培养基（氯霉素添加量为5 mg/100 mL）

PDA培养基：马铃薯20.0 g/100 mL，葡萄糖2.0 g/

100 mL，琼脂2.0 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL。

真菌2号培养基：味精1.0 g/100 mL，磷酸二氢钾0.05 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，酵母膏0.3 g/

100 mL，琼脂2.0 g/100 mL，麦芽糖2.0 g/100 mL，葡萄糖1.0 g/100 mL，甘露醇2.0 g/100 mL。

孟加拉红培养基：琼脂2.0 g/100 mL，孟加拉红3.6 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，pH 7.0。

1.1.3 发酵培养基

真菌2号培养基：味精1.0 g/100 mL，磷酸二氢钾0.05 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，酵母膏

0.3 g/100 mL，琼脂2.0 g/100 mL，麦芽糖2.0 g/100 mL，

葡萄糖1.0 g/100 mL，甘露醇2.0 g/100 mL。

大米培养基：大米80 g，海水120 mL。

1.1.4 试剂和仪器

HCB-1300V洁净工作台（青岛海尔特种电器有限公司）；Agilent 1260 HPLC（美国Agilent公司）；硅胶板（青岛海洋化工厂）；AL104分析天平（瑞士梅特勒公司）；YXQ-LS-75SII 高压灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；半制备C18柱（Nacalai tesque公司）; Brucker AVANCE 400 MHz核磁共振波谱仪（美国Brucker公司）；MAGNA-1R550傅里叶变换红外光谱（Thermo公司）；K3 TOUCH酶标仪（飞世尔实验器材有限公司）；CR-080R 型春霖超声波清洗机（深圳市春霖清洗设备有限公司）；LRH-500A生化培养箱（广东泰宏君科学仪器股份有限公司）；Mariner API-TOF型质谱仪（美国应用生物系统公司）；Agilent Cary 60紫外可见光谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；提取分离用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇（成都市科隆化学品有限公司）均为工业用化学纯产品。

1.2 样品预处理与菌株分离及保藏

样品预处理：将样品用自来水冲洗干净后带入超净台，用无菌水将植物样品洗净后取其根、茎、叶和花各部位的一小部分加入适量无菌水进行研磨，用无菌枪头吸取10 mL于离心管作为母液。取1 mL母液加9 mL无菌水混合即得10倍稀释液。

菌株分离：采用10倍稀释法分离纯化样品真菌，各取1 mL稀释液均匀地涂布于3种分离培养基平板（孟加拉红培养基、真菌2号培养基、PDA培养基），每个稀释度涂布两个平板，放入28 ℃恒温培养箱中培养3～4 d。挑取培养基中的单菌落进行纯化，若出现染菌则挑取此菌落做进一步划线分离，重复操作直至获得单菌落。

菌株保藏：将纯化得到的菌株接入PDA斜面培养基，28 ℃恒温培养后于4 ℃冰箱进行斜面保藏; 将纯化菌株接入含有20%甘油的PDA液体培养基甘油管，28 ℃恒温培养后于-20 ℃冰箱进行甘油管保藏。

1.3 菌株的筛选

1.3.1 菌株发酵

保藏于斜面的菌株接种到灭菌的真菌二号培养基及大米培养基中静置发酵30 d。

1.3.2 菌株鉴定

植物内生真菌MDCW-573菌株鉴定，包括基因组DNA的提取、扩增、纯化和测序，均在上海生工生物工程股份有限公司进行。基于形态及生理生化特征、运用NCBI数据库对真菌ITS序列进行比较，运用软件MEGA（Version 7.0）对菌株系统进化树进行绘制。

1.3.3 发酵产物的提取与分离

大米培养基下发酵：发酵结束后将大米捣碎，用等体积的乙酸乙酯浸泡并超声萃取3次，经减压浓缩得浸膏。真菌二号培养基下发酵：加入等体积乙酸乙酯并用破碎机破碎，超声萃取3次后减压浓缩得浸膏。

1.4 活性测试

1.4.1 抗氧化活性测试

采用DPPH法测定化合物的抗氧化活性[22]，评价其自由基清除能力。以MeOH为溶剂，分别配制

20 μmol/L样品溶液（a）和VC溶液（b）及0.15 μmol/L的DPPH溶液（c）。将样品+DPPH（160 μL a + 40 μL c）、样品对照（160 μL a + 40 μL MeOH）、VC+DPPH（160 μL b + 40 μL c）、阳性对照（160 μL b + 40 μL MeOH）、阴性对照（160 μL MeOH + 40 μL c）、空白（200 μL MeOH）加至96孔板，每孔设置3个平行。使用酶标仪测量517 nm处的A值，自由基清除率采用以下公式计算：

清除率=[A阴性对照-（A样品+DPPH-A样品对照）]/A阴性对照×100%

1.4.2 抑菌活性测试

采用微量二倍稀释法对化合物进行抑菌活性评价[23]， 96孔板中加入100 μL稀释100倍的菌液，测试药物浓度为256～0.5 μg/mL。使用环丙沙星为阳性对照，检测化合物对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）抑菌活性。

1.4.3 ECD计算

在Gaussian 09软件中使用密度泛函理论（DFT）进行计算[24]。具体步骤为：使用hyperchem软件进行初步构象搜索，在B3LYP/6-31G（d）水平上进行进一步的几何优化，用SCRF/PCM方法在相同的DFT水平上评价了甲醇溶液的溶剂效应，用B3LYP/6-31G（d）下的TDDFT计算了化合物甲醇中的电子激发能和旋转强度。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

采用10倍稀释法从小叶海金沙、野牡丹和莲子草等3种植物样品中分离获得171株真菌，形态见图1，菌株分离情况统计见图2。

（1）小叶海金沙（64株）： MDCW-428、MDCW-431、MDCW-440、MDCW-455、MDCW-458～460、MDCW-463～464、MDCW-475、MDCW-478、MDCW-479、MDCW-481、MDCW-484～485、MDCW-491～492、MDCW-496～497、MDCW-513～515、MDCW-517、MDCW-519、MDCW-522～523、MDCW-526～528、MDCW-532、MDCW-536～540、MDCW-541、MDCW-542、MDCW-545、MDCW-547、MDCW-548、MDCW-550、MDCW-554、MDCW-556～558、MDCW-560、MDCW-563、MDCW-565、MDCW-566、MDCW-571～575、MDCW-578、MDCW-581、MDCW-583～584、MDCW-586～588、MDCW-593、MDCW-595、MDCW-596～597。

（2）野牡丹（33株）： MDCW-433、MDCW-435、MDCW-468、MDCW-477、MDCW-480、MDCW-493、MDCW-495、MDCW-499、MDCW-502、MDCW-504、MDCW-505、MDCW-507、MDCW-511、MDCW-516、MDCW-525、MDCW-530、MDCW-543、MDCW-544、MDCW-546、MDCW-551、MDCW-552、MDCW-555、MDCW-559、MDCW-568、MDCW-579、MDCW-580、MDCW-582、MDCW-585、MDCW-589、MDCW-590、MDCW-591、MDCW-592、MDCW-605。

（3）莲子草（74株）： MDCW-426～427、MDCW-429～430、MDCW-432、MDCW-434、MDCW-436～439、MDCW-442～462、MDCW-465～467、MDCW-469～474、MDCW-476、MDCW-482、MDCW-483、MDCW-486～490、MDCW-494、MDCW-498、MDCW-500～501、MDCW-503、MDCW-506、MDCW-508～510、MDCW-512、MDCW-518、MDCW-520～521、MDCW-524、MDCW-529、MDCW-531、MDCW-533～534、MDCW-539、MDCW-549、MDCW-553、MDCW-561～562、MDCW-564、MDCW-567、MDCW-569～570、MDCW-576～577、MDCW-594。

2.2 菌株鉴定

PCR扩增MDCW-573菌株的ITS序列长度为568 bp，与NCBI数据库中的斯氏霉属菌株在系统发育树上处于同一分支如图3所示，呈现出高度的相似性[25]。对其形态特征做进一步观察，发现与斯氏霉属菌株的形态特征一致。故初步鉴定菌株MDCW-573（GenBank 登录号OR 121523）为斯氏霉属菌株，并命名为 Spegazzinia sp. MDCW-573。

2.3 化合物的分离与鉴定

对Spegazzinia sp. MDCW-573 （来源：小叶海金沙；真菌二号分离培养基；10倍稀释菌液）真菌二号发酵培养基（发酵6 L）中的次级代谢产物进行分离，采用凝胶柱色谱技术，以1：1的比例使用二氯甲烷和甲醇进行洗脱，并进行TLC检测以合并共得到4个组分Fr.1～Fr.4。Fr.4通过HPLC半制备（C18半制备柱，甲醇：水 ＝ 45：55，流量4 mL/min）纯化，得到化合物1 （21.2 mg，tR ＝ 9.0 min），2 （35.6 mg，tR ＝ 10.0 min），3 （11.3 mg，tR ＝ 20.0 min）。通过MS和NMR鉴定3个化合物分别为3-epi-lignicol，lignicol和6-demethylkigelin（图4）。

化合物1：蓝色固体；+47.6 （c 1.1， MeCN）；正离子高分辨质谱HR-ESI-MS在m/z 241.0703给出准分子离子峰[M+H]+，提示分子式为C11H12O6。红外光谱给出羟基和羰基（3373 cm-1和1660 cm-1）等官能团的特征吸收峰。UV（nm）： 306 （0.16）， 272 （0.43）， 218 （0.82）nm，

该化合物与已知化合物lignicol（2）[26]具有相同的紫外吸收，初步判断其也为异香豆素类化合物。化合物1的13C-NMR（表1）和HSQC谱图给出1个羰基碳（δC 171.3）、6个苯环或双键碳（δC 158.4， 157.3， 139.1， 136.2， 108.5， 101.3）、2个含氧sp3次甲基（δC/H 79.8/4.63， 67.6/4.41）以及2个甲基（δC/H 60.9/3.84， 16.3/1.48），包括1个含氧甲基。这些数据与化合物2的核磁共振波谱数据非常相似[26]，只是化合物1中C-2、C-3和C-4的化学位移（δC 16.3、79.8和67.6）与化合物2中（δC 18.1、81.3和69.4）相比均向高场位移。化合物1的1H-1H COSY给出H-2/H-3的相关信号；其HMBC谱图给出H-2与C-3、C-4，H-3与C-2、C-4，H-4与C-3、C-5、C-9、C-10，H-5与C-1、C-4、C-6、C-7、C-9，以及H-11与C-7的相关信号（图5）。以上数据提示化合物1和2具有相同的平面结构，区别仅是C-3和C-4位手性碳的相对构型不同，故化合物1的H-3和H-4被确定为同面，与化合物2中相反。1的绝对构型是通过量子化学ECD计算确定的，计算和拟合结果显示化合物1的实测ECD谱图和（3S，4S）-1的计算谱图具有较好的吻合（图6），证明化合物的绝对构型为3S和4S。化合物1的名字命名为3-epi-lignicol。

化合物2：白色固体，ESI-MS： m/z 241.0 [M+H]+，分子式为C11H12O6，比旋光值+38.6 （c 2.8， MeCN）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 6.60（1H，s，H-5），4.44（2H，m，H-3，4），3.83（3H，s，H-11），1.44（3H，d，J = 5.9 Hz，H-2）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz） δ： 170.4（s，C-1），158.7（s，C-6），157.3（s，C-8），140.2（s，C-10），135.6（s，C-7），106.5（d，C-5），100.8 （s，C-9），81.3（d，C-3），69.4（d，C-4），60.9（q，C-11），18.1（q， C-2）。以上数据与文献[26]对比，鉴定化合物2为 lignicol。

化合物3：白色固体，ESI-MS： m/z 225.0 [M+H]+，分子式为C11H12O5，比旋光值-35.3 （c 0.9， MeOH）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 6.28（1H，s，H-5），4.68～4.63（1H，m，H-3），3.82（3H，s，H-11），2.90～2.75（2H，m，H-4），1.46（3H，d，J= 6.2 Hz，H-2）；13C NMR（CD3OD，100 MHz）δ： 171.8（s，C-1），158.4（s，C-8），157.6（s，C-6），137.5（s，C-10），135.0（s，C-7），107.8（d，C-5），102.2（s，C-9），77.6（d，C-3），60.9（q，C-11），35.1（t，C-4），20.8（q，C-2）。以上数据与文献[27]对比，鉴定此化合物3为6-demethylkigelin。

2.4 活性测试结果

2.4.1 抗氧化活性测试结果

在20 μmol/L的浓度下3个化合物均不显示明显的抗氧化活性，其DPPH清除率分别是6.9%、26.1%和13.5%，阳性对照VC的清除率为92.1%。

2.4.2 抑菌活性测试结果

对3个单体化合物进行抑菌活性测试后，发现化合物1、3对金黄色葡萄球菌有抑制活性，此外化合物1还对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有抑制活性。化合物1、3的最小抑菌浓度（MIC）如表2所示。

3 讨论

本研究通过10倍稀释法从来源于广西北部湾的3种药用植物小叶海金沙、野牡丹、莲子草中分离获得了171株真菌，其中10倍稀释液分离真菌数量多于母液。对从小叶金海沙中分离的内生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573的真菌2号液体发酵次级代谢产物进行分离鉴定，获得3个异香豆素类化合物且化合物1为新化合物。化合物1对金黄色葡萄球菌及MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC为128 μg/mL。化合物3对MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC为128 μg/mL。化合物1～3均不显示明显的抗氧化活性。

4， 6， 8-三羟基-7-甲氨基-3-甲基二氢异香豆素（lignicol）首次分离于柱顶孢霉属Scytalidium sp.，而后又在Parapyenchaeta sp. SGSF449的发酵物中被分离。本研究首次从斯氏霉属Spegazzinia sp.菌株中分离得到lignicol。以往研究证明lignicol对于丁香假单胞菌（P. syringae）、水稻黄单胞菌（X. oryzae）、青枯劳尔菌（R. solanacearum）有微弱的抗菌活性，MIC为500 μg/mL。本研究进一步发现在药物浓度为256～0.5 μg/mL下其对金黄色葡萄球菌和MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）无明显抑菌活性。

6-demethylkigelin可作为植物生长调节剂抑制高浓度下IAA对植物根生长的抑制作用。以往研究表明该化合物对丁香假单胞菌（P. syringae）、青枯劳尔菌（R. solanacearum）、甘蓝黑腐黄单胞菌（X. campestrus）、水稻黄单胞菌（X. oryzae）具有微弱的抑菌活性MIC为500 μg/mL。本研究发现其对MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC为128 μg/mL。

目前对于广西北部湾植物内生真菌次级代谢产物活性研究相对较少，以前的研究多数停留在菌株分离鉴定及粗提物活性初筛上，对菌株次级代谢产物的研究尚不深入。迄今为止，针对斯氏霉属真菌的次级代谢产物研究很少，本研究得到的3个化合物均为首次从斯氏霉属真菌中分离得到，本研究结果极大丰富了斯氏霉属内生真菌的次级代谢产物多样性研究，为进一步开发利用北部湾真菌资源打下了基础。

参 考 文 献

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