GB 4789.35《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》新旧标准比较及操作疑难解析

吴九玲

摘 要：相较于GB 4789.35—2016版本《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》，

GB 4789.35—2023版本新标准在乳酸菌的定义、设备与材料、样品制备、培养条件、选做方法等方面均进行了较大的修改。乳酸菌检验过程中，稀释液的制备、包埋产品的样品前处理、厌氧培养实施等环节均存在一定难度，检验时需根据实际情况选择合适的实施方案。有必要对乳酸菌检验人员进行及时的培训，以保证新标准的顺利实施。

关键词：乳酸菌检验；国家标准；样品制备；培养条件

Comparison of New and Old Standards and Analysis of Operational Difficulties in GB 4789.35 National Standard for Food Safety， Microbiological Examination of Food for Lactic Acid Bacteria Testing

WU Jiuling

（Shenzhen City Vocational College， Shenzhen 518116， China）

Abstract： Compared with GB 4789.35—2016， the new standard of GB 4789.35—2023 has made major modifications in the definition of lactic acid bacteria， equipment and materials， sample preparation， culture conditions， selection methods， etc. In the process of lactic acid bacteria testing， there are certain difficulties in the preparation of diluents， sample pre-processing of embedded products， and implementation of anaerobic culture. During testing， it is necessary to choose an appropriate implementation plan based on the actual situation. It is necessary to provide timely training for lactic acid bacteria inspection personnel to ensure the smooth implementation of the new standards.

Keywords： lactic acid bacteria testing; national standards; sample preparation; culture condition

2023年9月6日，国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局联合印发2023年第6号公告，公告明确《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2023）（简称新标准）将替代GB 4789.35—2016（简称旧标准），新标准于2024年3月6日起正式实施。

新标准较旧标准更加严谨、科学，其中变化最大的部分是新增实时荧光PCR方法作为选做方法，为乳酸菌的鉴定提供了新的检测依据。乳酸菌检验人员有必要了解GB 4789.35—2023标准的变化之处、化解检验操作中的疑难环节，以保证新标准的顺利实施。

1 GB 4789.35—2023标准解读

和GB 4789.35—2016比较，GB 4789.35—2023版本《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》的具体变化如下。

1.1 修改了“2.1乳酸菌的定义”

GB 4789.35—2023参照国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）的相关标准，进一步完善了乳酸菌定义，在乳酸菌的定义中增加了对乳酸菌生化现象的描述。旧标准只是描述了乳酸菌是一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称，主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。新标准则增加了对乳酸菌生化现象的描述：不能液化明胶、不产生吲哚、革兰氏阳性、无运动、无芽孢、触酶阴性、硝酸还原酶阴性及细胞色素氧化酶阴性反应的细菌。

1.2 修改了“3设备与材料”

（1）增加样品处理、培养所用的设备和材料：厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或能够提供同等厌氧效果的装置、涡旋混匀仪、恒温水浴锅或金属浴。

（2）增加实时荧光PCR法的设备和材料：实时定量PCR仪、离心机、微量移液器和灭菌吸头、PCR管等。

（3）电子天平精度由0.01 g改为0.001 g。

（4）冰箱温度范围由2～5 ℃改为2～8 ℃。

1.3 修改了“4培养基和试剂”

（1）针对现有稀释液对某些乳酸菌计数结果偏低的情况，修改了样品前处理时所用稀释液成分和温度。新标准用稀释液替代旧标准的生理盐水，稀释液主要成分为0.85% NaCl和1.5%胰蛋白胨，经验证，稀释液“生理盐水+1.5%胰蛋白胨（37 ℃预热）”在乳酸菌检验中，计数结果优于其他稀释液，更有利于乳酸菌的复苏。

（2）修改MRS琼脂培养基和MC琼脂培养基部分成分含量。

（3）增加实时荧光PCR法的试剂：DNA提取液、10×PCR缓冲液、dNTPs、Tap DNA聚合酶、7种乳酸菌引物探针和灭菌去离子水等。

1.4 修改了“6.1样品制备”

（1）增加稀释液在试验前应在36 ℃±1 ℃条件下充分预热15～30 min的操作。

（2）液体样品处理步骤中，增加拍击式均质器拍打的操作。

（3）增加“6.16经特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌食品样品应在相应技术/工艺要求下进行有效前处理”的操作。特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌食品样品经过有效前处理，其乳酸菌检验结果会更加准确。

1.5 修改了“6.3.2、6.3.3、6.3.4中的培养条件”

（1）新标准要求倾注的培养基温度在48～50 ℃，倾注的量在15～20 mL，与旧标准相比更方便实验操作。

（2）旧标准双歧杆菌、嗜热链球菌、乳杆菌统一选择36 ℃±1 ℃培养72 h±2 h，而新标准则根据这3种菌的生长特性，选择36 ℃±1 ℃培养48 h，若菌落无生长或生长较小可选择延长培养至72 h。

1.6 修改了“6.4菌落计数、6.5结果的表述、6.6菌落数的报告”

旧标准“6.3菌落计数、6.4结果的表述、6.5菌落数的报告”分别对菌落计数的规则、结果的表述方法、菌落数的报告规则进行了详细的说明；新标准由于GB 4789.2—2022结果计数及报告很详尽清晰，直接引用了GB 4789.2—2022中相关内容，可避免重复，使得新标准内容更加简洁。

1.7 增加了“8.2第二法 实时荧光PCR法鉴定”作为选做方法

旧标准中“8乳酸菌的鉴定（可选做）”只有生化鉴定方法，新标准增加了“8.2第二法 实时荧光PCR法鉴定”，可鉴定常见的干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌，有较高的准确性和特异性[1]，且检出限低于0.1 ng·μL-1，可以根据需求选择适宜的检测方法。

2 GB 4789.35—2023操作疑难解析

根据新标准的规定进行检验操作，乳酸菌检验过程有很多步骤存在一定的疑难点，需要根据新标准修订的目的进行分析并落实。

2.1 稀释液的准备

6.1.2规定稀释液在试验前应在36 ℃±1 ℃条件下充分预热15～30 min，目的是促进乳酸菌的复苏，同时满足“样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序”。在实际操作中，常用的解决办法有2种：①将提前灭菌好的稀释液置于36 ℃±℃水浴锅内保温，要求水浴锅保温期间不得污染稀释液，从水浴锅内取出稀释液后要及时对稀释液外包装进行消毒，且恒温水浴锅离接种操作台不得太远，以防止稀释液从培养箱取出后迅速降温；②将提前灭菌好的稀释液置于36 ℃±1 ℃恒温培养箱内保温，该方法操作简单，但也要求恒温培养箱离接种台距离近，以防止稀释液从培养箱取出后迅速降温。具体选择哪一种方法应根据实验室条件确定。

2.2 特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌样品的前处理

特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌样品的前处理要求简单可行，尽可能减少对乳酸菌的影响。目前，乳酸菌包埋技术有很多，传统的包埋技术主要包括挤压法、冷冻干燥法和喷雾干燥法，前沿的包埋技术有乳化法、复合凝聚法和多层包埋技术等[2]。

（1）挤压法处理的乳酸菌产品是将微生物与海藻酸钠溶液混合制成菌悬液，然后采用挤压方式将微生物悬浊液以液滴的形式注射到氯化钙溶液中，形成含有微生物的不溶性微粒[3]。挤压法处理的乳酸菌产品菌活性保持较好，做乳酸菌检验时只需适当的水溶性稀释剂溶解即可。

（2）冷冻干燥法处理的乳酸菌产品通常使用的冷冻保护剂有渗透型保护剂（如甘油）、半渗透保护剂（如蔗糖、海藻糖）、非渗透保护剂（如乳清蛋白、脱脂乳）等[4]。因此，冷冻干燥法处理的乳酸菌产品前处理只需要适当的水溶性稀释剂溶解即可。冷冻干燥法处理的乳酸菌产品中乳酸菌细胞活力下降[5]，因此在样品溶解、稀释过程中需要提供适当的条件恢复菌活力。

（3）喷雾干燥法处理的乳酸菌产品一般是将乳化液与乳酸菌浓缩液低温混合，分散均匀形成乳化液，通过雾化装置雾化成微小液滴，进一步受热干燥固化形成粉状微胶囊[6]。由于处理温度普遍较高，因此喷雾干燥法处理的乳酸菌产品前处理时需要选择合适的乳化剂乳化溶解，同时需要在样品处理时提供适当的条件恢复菌活力。

不同包埋技术处理的乳酸菌产品需要不同的样品前处理方法。因此，在处理特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌样品之前，需要详细了解含乳酸菌样品的生产工艺，选择适当类型的稀释剂，要控制样品处理温度和时间，应尽可能减少对乳酸菌的损伤并使细胞活力得到最大限度的恢复，但要避免样品中的乳酸菌在样品前处理时发生增殖。

2.3 双歧杆菌、嗜热链球菌、乳杆菌的培养

新标准对乳酸菌的培养条件进行了修订，根据双歧杆菌、嗜热链球菌、乳杆菌3种菌的生长特性，选择36 ℃±1 ℃培养48 h，必要时可培养至72 h，和旧标准相比节省了出报告的时间。根据新标准规定，双歧杆菌、乳杆菌需要厌氧培养，而厌氧培养方法的选择直接影响培养结果及报告。目前常见的厌氧培养是通过厌氧培养箱、厌氧培养罐、厌氧袋、Hungate管、厌氧工作站等设施、设备提供厌氧培养环境。

（1）厌氧培养箱法。厌氧培养箱法是在恒温培养箱的基础上增加气体置换装置进行厌氧培养的方法。在箱体内使用预制无氧混合气进行洗吹，达到降低氧浓度的目的。厌氧培养箱容量较大，使用方便，操作方法类同于恒温培养箱，待环境生成后，可根据需求放入培养皿、均质袋、增菌瓶、三角瓶等。厌氧培养箱的缺点是维护成本高，密封件和氧传感器容易老化，需定期检查、更换；设备投入大，使用成本高，需要频繁更换气瓶，培养阳性率低；灵活性差，环境生成时间长，不能随开随用；同时仅能生成一种气体环境和温度，不能满足日常实验的多样化需求。厌氧培养箱适用于单一乳酸菌品种、厌氧培养量较大的工作场景。

（2）厌氧培养罐法。厌氧培养罐法是用物理、化学方法使缸内生成厌氧环境，从而进行厌氧菌培养的方法。厌氧罐法又分为抽气换气法和气体发生袋法。抽气换气法通过反复抽气、充气的方法可迅速建立厌氧环境，罐中需放入冷催化剂钯粒和美蓝指示管。气体发生袋是由锡箔密封包装，其中含有2种药片，一种遇水放出二氧化碳，另一种可释放氢，厌氧罐内需有钯粒、指示剂，密封后1 h左右罐中的O2含量可低于1%。

（3）厌氧袋法。厌氧袋法是运用化学法消耗容器中的氧气生成二氧化碳和水，配套密封盒或密封袋使用的一次性厌氧培养方法。厌氧袋法的优点是购买门槛低、拆包即用，缺点是容量有限、耗材费用高。厌氧袋法可用于临时应急，常年大量使用时建议选择参数可控、结果可溯源的设备类产品。

（4）Hungate管法。Hungate管法是一种可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离与活菌培养计数的厌氧培养方法。Hungate管分螺纹型和铝封型，螺纹型由玻璃培养管、丁基橡胶塞以及旋盖组成；铝封型由玻璃培养管、丁基橡胶塞以及铝封盖组成，需配套封盖器。采用Hungate管法进行厌氧培养时可通过针孔注射器抽取真空，橡胶塞可多次被穿孔并保持密封。该法优点在于培养基可以在厌氧管内壁上形成一层均匀透明的薄层，菌落可以生长在培养基内部或表面，同平板涂布法相比，与氧气接触的机会大大减少。

（5）厌氧工作站法。厌氧工作站法是利用厌氧工作站进行厌氧培养的方法。厌氧工作站的气体置换原理与厌氧培养箱的气体置换原理相同，可以对培养温度、培养湿度进行控制。箱体一般由高透明亚克力板拼接而成，前面板设置手套，可供实验人员将手伸入进行操作，满足厌氧环境下进行分离、接种等操作的需求。厌氧工作站最大的优势是厌氧环境下在线操作。其缺点是维护成本高，相比厌氧培养箱，密封件更复杂，需专业人员上门维护；维护量及成本加剧；灵活性差，不具备随开随用的功能，亦无法同时生成不同的培养环境，不能满足多样化需求；培养时设备24 h待机，达到设定环境后也需要耗气等。厌氧工作站的投入是目前厌氧培养中最高的，更适用于科研。

在进行乳酸菌检验时可根据检验实际情况选择厌氧培养方法，常规检验量非常大时推荐厌氧培养箱，进行科研工作、经济允许的情况下可采用厌氧工作站，其他情况下可选择厌氧培养罐、厌氧袋、Hungate管等方法。

3 结语

GB 4789.35—2023新标准更加科学、规范、准确，也更有可操作性。有必要对相关检验人员进行及时的培训，使其了解标准修改内容，能对新标准的检验疑难环节进行分析并根据实际情况进行方案选择，以保证新标准能顺利实施。

参考文献

[1]赵文静，李妍，高鹏飞，等.实时荧光定量PCR技术在乳酸菌定量检测中的应用[J].食品与生物技术学报，2009，26（4）：255-235.

[2]陈臣，张晓丛，袁海彬，等.益生菌包埋前沿技术及其研究进展[J].中国食品学报，2023，23（1）：384-396.

[3]张慧娟，郝一铭，王静，等.微生物包埋技术的研究进展[J].食品工业科技，2016，37（1）：381-386.

[4]苗维娜，赵亮.冷冻干燥影响乳酸菌发酵活力机制的研究进展[J].食品工业科技，2022，43（21）：36-44.

[5]李明慧，尚一娜，霍麒文，等.真空冷冻干燥对乳酸菌损伤机制的研究进展[J].食品科学，2018，19（39）：273-279.

[6]刘仁杰，李哲，毛思凝，等.乳酸菌微胶囊包埋技术与常用壁材的研究进展[J].食品与机械，2019，35（9）：

211-215.