分子生物学技术在食品微生物检测中的应用

焦宪军 董桂花

摘 要：本文详细探讨了聚合酶链反应、实时荧光定量聚合酶链式反应、扩增片段长度多态性分析、核酸适配体以及CRISPR-Cas系统等分子生物学技术在食品微生物检测中的应用，总结出这些技术的具有检测敏感度高、特异性好、检测时间短，以及能够扩大检测范围等优势，可为食品安全检测提供高效、灵活的工具。

关键词：分子生物学；食品；微生物检测

Application of Molecular Biology Techniques in Food Microbial Detection

JIAO Xianjun， DONG Guihua

（Department of Microbiology， Zhangqiu Center for Disease Control and Prevention， Jinan 250200， China）

Abstract： In this paper， the application of molecular biology techniques such as polymerase chain reaction， real-time polymerase chain reaction， amplified fragment length polymorphism analysis， aptamers and CRISPR-Cas systems in the detection of food microorganisms is discussed in detail， and it is concluded that these technologies have the advantages of high detection sensitivity， good specificity， short detection time， and can expand the detection range， which can provide efficient and flexible tools for food safety detection.

Keywords： molecular biology; food; microbial detection

近年来，食品安全问题日益突出，已受到消费者的广泛关注。传统的微生物检测方法已逐渐无法满足快速、准确的检测需求。分子生物学技术以其高特异性、检测快速、应用范围广泛的特点，逐渐成为食品微生物检测的重要工具。这些技术通过直接分析微生物的遗传物质实现对目标物质的检测，不仅能够提供更准确的检测结果，还适用于各种复杂的食品样本[1]。

1 分子生物学技术在食品微生物检测中的优势

1.1 高特异性

传统的微生物检测方法如培养和生化测试虽然被广泛使用，但通常面临灵敏度和特异性不足的问题，无法准确快速地识别特定微生物。分子生物学技术的应用，特别是针对微生物核酸的检测，极大地提高了食品微生物检测的特异性。分子生物学技术凭借靶向微生物的遗传物质（DNA或RNA）进行识别和检测，通过利用微生物基因序列的独特性，可以精确地区分不同种类的微生物，甚至在物种层面上进行区分。

通过设计特异性极高的引物和探针，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）可以特异性地扩增目标微生物的特定DNA序列，从而确保检测结果的准确性，这种高特异性识别不仅提高了检测结果的准确率，还降低了交叉反应的风险，是传统方法难以比拟的[2]。除此之外，分子技术还能够准确识别复杂样本中健康风险较高的病原体，通过特异的分子标记实现对每一种病原体的精确检测，能够有效避免误诊和漏诊的问题。

1.2 检测快速

分子生物学技术中，PCR技术及其变体如实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR），能够在几小时内完成微生物的检测和定量。这种技术的快速性主要源于其直接针对微生物的遗传物质进行分析，省去了传统培养过程中耗时较长的孵化步骤。qPCR技术通过实时监测扩增过程中荧光信号的变化，能够即时提供关于微生物数量的精确信息，这对于快速识别食品中的病原体和保证公共卫生安全尤为快捷。

分子生物学技术的自动化程度高，可以通过现代化的实验设备，如自动化PCR仪器，进一步加快检测过程。自动化设备减少了人工操作的需求，提高了检测的一致性和重复性，同时缩短了样品处理和分析的时间。在食品安全事件的紧急处理中，这种高效的工作流程极大地提升了食品安全管理的实时性和有效性。

1.3 应用范围广泛

分子生物学技术在食品微生物检测领域的一个显著优势是应用范围广泛。分子生物学不受样本类型的限制，可以在固体、液体以及半固体食品中进行微生物检测，覆盖了肉制品、乳制品、海产品、饮料以及预制食品等多种食品类别。

分子生物学技术在各种食品微生物检测中的应用与其高度的灵活性密不可分。分子生物学技术的灵活性表现在其能够与其他技术如次世代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）和基因编辑工具（如CRISPR-Cas系统）结合使用。这种结合不仅可以用于检测已知的食品病原体，还可以探索未知的微生物种类，能够拓展食品微生物安全领域的研究深度和广度。例如，通过NGS可以对食品样品中的微生物群落进行全面分析，识别出所有存在的微生物种类，包括那些未被标准方法检出的微生物。

2 分子生物学技术在食品微生物检测中的应用

2.1 聚合酶链式反应

PCR是一种革命性的分子生物学技术，自发明以来，已广泛应用于医学、法医及生物学研究领域，并在食品安全检测领域中扮演着至关重要的角色。PCR技术的核心在于能够从混合的DNA样本中，快速、准确地扩增出微量的特定DNA片段，能够检测极少量的微生物DNA[3]。

在食品微生物检测中，PCR技术主要被用来识别和量化食品样品中的病原体。通过设计特定于目标微生物的引物，PCR能够特异性地扩增相关遗传标记，从而确认其存在。这种方法不仅对常见的细菌如沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等具有高度的敏感性，还能检测到那些难以用传统培养方法检测到的微生物，如某些病毒和原核生物。

在食品微生物检测中，PCR技术具有操作简便、检测速度快等优势。传统的微生物培养检测可能需要几天到几周才能得到结果，而PCR技术可以在几小时内完成检测，大大加快了食品安全检测的响应时间。此外，PCR技术还具备高度的灵活性，可以适应不同类型的检测需求，可通过多重PCR同时检测食品中的多种病原体。

2.2 实时荧光定量PCR

qPCR是PCR技术的一个先进变体，在食品微生物检测中能够实现快速、准确、定量检测。qPCR技术是在传统PCR技术的基础上引入荧光化学物质，以达到实时监测PCR反应过程的目标，同时通过扩增产物量的变化情况可对初始模板量进行定量分析，为食品安全监测提供了更深入的数据支持[4]。

在食品安全领域，qPCR技术的应用主要集中在对食品中病原体的快速识别和数量评估上。通过使用特定的荧光标记探针或荧光染料，qPCR能够通过在DNA扩增过程中产生的荧光信号准确识别目标DNA序列，从而实时追踪扩增过程。这种实时监测不仅提高了检测的特异性，还大幅提升了检测的灵敏度，即使在非常低的微生物负荷下也能进行有效检测。此外，qPCR技术还具有高度自动化和标准化能力，极大地减少了人为操作的误差，确保了实验结果的一致性和重复性。这种高效率和高准确性的特点使qPCR成为食品生产和加工过程中重要的质量控制工具。

2.3 扩增片段长度多态性分析

扩增片段长度多态性分析（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是一种强大的分子标记技术，通过检测DNA中的多态性来区分不同微生物种类或菌株。在食品微生物检测中，AFLP提供了一种高分辨率的遗传指纹技术，能够精确识别和区分食品中的微生物群体，在食品安全溯源和微生物多样性研究中尤为重要。

AFLP技术的核心是利用特定的酶对DNA样本进行消化，随后选择性地扩增部分片段，形成独特的DNA指纹图谱。应用过程中不需要预先了解DNA序列信息，适用于还未被充分研究的微生物群体。在食品微生物检测中，AFLP能够区分表型相似但基因型不同的微生物菌株，为识别特定的病原体或评估微生物群体的遗传多样性提供了强有力的工具。

在实际应用中，AFLP技术尤其适用于复杂食品样品中的微生物分析。例如，在食品暴发性疫情追踪中，通过比较不同样品中的微生物AFLP图谱，可以识别出疫情源头或传播途径中的特定微生物菌株，这对于控制和预防食品安全事件具有重要价值。AFLP技术在食品微生物检测中的应用不仅限于病原体识别，还可用于探索食品中益生菌的多样性和稳定性，这对于开发和评估功能性食品特别重要。通过分析食品中益生菌的遗传多样性，可以优化菌株的选择和培养条件，从而提高食品的健康价值和市场竞争力。

2.4 核酸适配体

核酸适配体（Aptamers）是一种单链核酸分子，通过体外化学合成获得，能特异性地结合到目标分子。在食品微生物检测领域，适配体技术因其高度的特异性和稳定性，被用作识别和捕捉特定微生物的生物识别元件。

适配体的选择过程称为体外适配体生成技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX），通过这一技术可以筛选出与目标微生物表面抗原特异性结合的适配体，适配体具有高亲和力和高特异性，使得它们在检测食品中的病原体时能够提供极高的灵敏度和准确性。适配体可用于直接检测微生物，或用于增强其他检测技术如酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和PCR的性能，通过提供一种直接且快速的检测手段来改善传统方法的灵敏度和特异性。适配体还被用于构建各种传感器和检测平台，如适配体功能化的纳米粒子、电化学传感器和荧光标记系统，这些高度定制的检测系统能够在复杂的食品样本中快速识别出微生物污染物，甚至在没有显著表型差异的微生物菌株之间进行区分。此外，适配体合成过程不依赖于生物体系，可以在没有生物安全隐患的情况下进行大量生产，并且这些适配体通常具有很好的热稳定性和化学稳定性，适合在不同的环境条件下使用。这些优势使其成为食品加工和储存过程中理想的微生物监测工具。

2.5 CRISPR-Cas系统

CRISPR-Cas系统作为一种先进的基因编辑技术，近年来在食品微生物检测领域展示出了巨大的应用潜力。其核心机制是基于一种能够精确识别并切割特定DNA序列的蛋白质，该属性使得CRISPR-Cas系统不仅在基因疗法和生物工程中被广泛研究，还被应用于快速、高效的病原体检测中。

在食品安全监测过程中，CRISPR-Cas系统可以针对特定食品病原体的遗传标记进行识别，一旦识别到这些标记，Cas蛋白将特异性地切割这些DNA片段，通过后续的信号放大，这种变化可以被快速检测出来，从而实现对病原体的快速识别[5]。在这个过程中，CRISPR-Cas系统表现出了高度的特异性和灵敏性，即使在复杂的食品样本中也能有效工作。CRISPR-Cas技术的另一大优势是其灵活性和可扩展性。研究人员可以通过设计不同导向RNA（gRNA）实现对多种病原体的检测，这使得CRISPR-Cas系统可以在单一平台上实现对多种病原体的同时检测，极大地提高了食品安全检测的效率和覆盖范围。

随着科技的进步，CRISPR-Cas系统可以结合现代微流控技术和便携式设备，开发出新型的现场快速检测工具，极大地简化了检测流程，使得在采集点如农场、加工厂直接进行快速检测成为可能。这对于提高食品供应链的监控效率和及时应对食品安全事件具有重要意义。

3 结语

分子生物学技术的不断发展与创新不仅提高了检测效率和准确性，还拓宽了检测范围，有效解决了复杂食品样本中的微生物检测难题。从PCR技术到CRISPR-Cas系统，这些技术在食品安全监测中发挥着重要的作用。未来，随着分子生物学技术的不断进步和优化，其在食品安全检测领域的应用将更加广泛和深入。为了最大限度地发挥出这些技术的潜力，建议进一步研究其在实际食品检测中的应用效果，并探索其与其他生物技术联合应用的可能，以提供更全面、更高效的食品安全解决方案。

参考文献

[1]赵青，刘欣，牛洪梅，等.食源性致病菌活的不可培养状态诱导、复苏及检测的研究进展[J].食品科学，2023，44（21）：377-385.

[2]傅志丰，周鹤，张国利，等.食源性致病菌和腐败菌的快速检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2022，13（3）：859-865.

[3]朱紫纯，顾青，郦萍.食品微生物肉葡萄球菌的高效转化技术研究[J].中国食品学报，2023，23（8）：165-174.

[4]易艳，刘明东，蒋子敬，等.基于分子生物学原理技术检测肉制品中动物源性成分研究进展[J].食品与发酵工业，2023，49（4）：288-294.

[5]蔡奕凡.生物检测技术在食品检测中的应用研究[J].中国食品工业，2022（16）：76-78.