多菌种发酵石榴酵素工艺的优化

候吉超 姜蕾 宋晶晶 王月丽 程秀峰

摘 要：本研究利用单因素实验和均匀设计从5种乳酸菌（保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳双歧杆菌）中筛选合适的菌种，并优化其比例用于生产石榴酵素，利用正交实验优化石榴酵素发酵工艺。结果表明，复合菌中菌种组成及其质量比例为植物乳杆菌∶乳酸片球菌∶乳双歧杆菌=1.625∶1.250∶1.100，最佳发酵条件为白砂糖添加量13%，发酵时间36 h，发酵温度38 ℃，菌种添加量3%，在该条件下发酵的石榴酵素颜色鲜红，口感微甜，风味独特。

关键词：石榴；酵素；复合菌；均匀实验

Optimization of Process Conditions for Multi-Microbial Fermentation of Pomegranate Fermentation Juice

HOU Jichao， JIANG Lei， SONG Jingjing， WANG Yueli， CHENG Xiufeng

（College of Life and Geographic Sciences， Kashi University， Kashi 844000， China）

Abstract： In this study， the suitable strains from 5 lactic acid bacteria （Lactobacillus bulgaricus， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus acidophilus， Lactobacillus lactis， Bifidobacterium lactis） and their ratios were screened and optimised for the fermentation of pomegranate enzyme using a one-way experiment and a homogeneous design and the fermentation process of pomegranate enzyme was optimised using orthogonal test. The results showed that the ratios of composite bacteria （Lactobacillus plantarum， Lactobacillus lactis， Bifidobacterium lactis ） were

1.625∶1.250∶1.100， and the optimal fermentation conditions were as follows： 13% sugar addition， 36 h fermentation time， 38 ℃ fermentation temperature， and 3% bacterial species addition， and the pomegranate enzyme fermented under the conditions had a bright red colour， a slightly sweet texture， and a unique flavour.

Keywords： pomegranate; fermentation juice; compound microbial agent; uniform experiment

石榴（Punica granatum L.），是千屈菜科（Lythraceae）石榴属（Punica）落叶乔木[1]，其果实酸甜可口、鲜艳美观，富含维生素、氨基酸、黄酮等多酚类物质及必需微量元素，具有抗氧化、防止动脉硬化与细胞癌变、降低血脂、预防血糖升高等功效[2-3]。酵素是以水果、蔬菜为原料，利用益生菌发酵生产的，其含有丰富的维生素、矿物质等营养成分[4]。果蔬酵素中含有多种功能性成分，具有抗衰老、抗氧化、护肝、美容养颜等功效[5]。

本研究采用喀什当地盛产的水果——石榴为原料，用乳酸菌对石榴皮、石榴籽、石榴汁进行发酵，开发出一款营养价值丰富的石榴酵素饮料。本研究利用单因素和均匀实验对5种乳酸菌进行筛选，并利用正交实验对石榴酵素生产工艺进行优化，为后期石榴酵素的功能特性和风味特性研究以及中试生产提供理论和应用基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴、白砂糖、果胶酶本地购买；保加利亚乳杆菌HH-LB57、嗜酸乳杆菌HH-LA26、乳酸片球菌HH-PA29、植物乳杆菌HH-LP56、乳双歧杆菌HH-BA68购自陕西云奇生物科技有限公司；无水乙醇（AR）、碳酸钠、福林酚、氢氧化钠、没食子酸均由实验室提供。

PHSJ-4F pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、HH-S6数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）、JA2003N电子天平（上海诺萱科学仪器有限公司）、721G分光光度计（上海齐欣科学仪器有限公司）、5804R多功能台式离心机（北京宏达恒业科技有限公司）、DHG-9140A型恒温干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 总酚及总酸含量测定

总酚含量测定依据《刺梨及其制品中总酚含量的测定》（T/GZCX 020—2022）[6]。总酸含量测定依据《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》（GB 12456—2021）[7]。

1.2.2 发酵菌种筛选

取1 g菌粉溶于1 mL无菌水中，35～40 ℃下保温20 min。将石榴与无菌水按7∶3的质量比混合粉碎匀浆后，以100 mL浆液为基准，使用5种活化后的乳酸菌分别在37 ℃密闭发酵36 h，测定总酚含量、pH值、总酸含量，初步筛选菌种。选用不同添加量（0.2%～2.5%）的初筛菌种对石榴浆液分别

在37 ℃密闭发酵36 h，通过感官评价选出最佳添加量范围，为均匀实验提供基础。

1.2.3 均匀实验确定复合菌种接种比例

本研究选择1.2.2中初步筛选得到的植物乳杆菌、乳酸片球菌、乳双歧杆菌为考察因素，采用3因素8水平[U8（83）]的均匀实验，对菌种比例进行优化实验，均匀设计因素水平表如表1所示，同时利用均匀设计表（表2）、均匀设计使用表（表3）确定了均匀设计实验方案（表4）[8]。

1.2.4 石榴酵素发酵工艺单因素实验

基本配方：石榴粉碎经酶解后灭菌，与无菌水按7∶3的质量比混匀，以此质量为基准，pH调至6.00，以植物乳杆菌、乳酸片球菌、乳双歧杆菌的质量比为1.625∶1.250∶1.100组成的复合菌作为发酵菌种，接种量4.0%，糖添加量13%，37 ℃发酵36 h。

为研究糖添加量对石榴酵素感官品质的影响，向发酵液中加入不同量（9%、11%、13%、15%及17%）白砂糖。为研究发酵时间对石榴酵素感官品质的影响，分别发酵不同时间（12 h、24 h、36 h、48 h及60 h）。为研究发酵温度对石榴酵素感官品质的影响，将发酵液在不同温度（32 ℃、35 ℃、38 ℃、41 ℃及44 ℃）下发酵。为研究接种量对石榴酵素感官品质的影响，向发酵液中接种不同量的（2%、3%、4%、5%及6%）菌种[9]。

1.2.5 正交优化实验

在单因素实验的基础上，以石榴酵素感官评分作为响应值，对糖添加量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）、菌种添加量（D）4个因素进行考察，设计L9（34）正交实验[10]。正交实验因素与水平见表5。

1.2.6 感官评价

根据石榴酵素感官质量评分标准，对石榴酵素的色泽、气味、口感、组织状态进行感官评价（表6）。

2 结果与分析

2.1 发酵菌株的筛选

由表7可知，5种乳酸菌发酵36 h后，植物乳杆菌发酵产品pH值最低，乳酸片球菌发酵产品的总酚含量最高，乳双歧杆菌发酵产品的总酸含量最高，故选择植物乳杆菌、乳酸片球菌、乳双歧杆菌3种乳酸菌制备复合菌剂。

对筛选出的3种菌的添加量范围进行筛选，如图1、图2和图3所示，随着菌种添加量的增加，感官评分均呈现先增加后降低的趋势。随着菌种添加量增加，发酵产酸增多，糖酸比由多减少；菌种添加量过少时，糖剩余多，口感偏甜发腻；当植物乳杆菌添加量为1.5%、乳酸片球菌添加量为1.5%、乳双歧杆菌添加量为0.8%时，糖酸比协调，口感酸甜可口，感官评分最高；菌种添加量过高时，产酸较多，酸甜失调，感官评价值变低。因此确定植物乳杆菌最佳添加量在1.0%～2.0%、乳酸片球菌最佳添加量在1.0%～2.0%、乳双歧杆菌最佳添加量在0.5%～1.1%。

2.2 均匀设计确定菌种比例

由表8可得，8组实验样品pH值基本不变，总酸含量变化同样不大，第5组样品的总酚含量最高，达到12.74 mg·kg-1，因此复合菌质量比例确定为植物乳杆菌∶乳酸片球菌∶乳双歧杆菌=1.625∶1.250∶1.100。

2.3 单因素实验

2.3.1 糖添加量对石榴酵素品质的影响

由图4可知，随着糖添加量不断增加，石榴酵素口感呈现先增加后降低的趋势，当白砂糖添加量为13%时，石榴酵素口感最好，感官评分最高；白砂糖的量继续增加，甜度增大，口感变差，故选择白砂糖添加量为13%。

2.3.2 发酵时间对石榴酵素品质的影响

由图5可知，随着发酵时间的延长，石榴酵素的感官评分呈现先增加后降低的趋势，发酵36 h时感官评分最高，48 h时略有下降，60 h时明显降低，这与乳酸菌产酸造成酸甜失衡有关，通过感官评价确定发酵时间为36 h。

2.3.3 发酵温度对石榴酵素品质的影响

如图6所示，石榴酵素的感官评分呈先增加后降低的趋势，当温度较低，乳酸菌生长缓慢，酸产量低，口感偏甜；当温度为38 ℃时，感官评分最高，此时酵素味道酸甜适中，无榨汁时的涩味；随着温度继续升高，乳酸菌繁殖速度过快，代谢旺盛，生长周期缩短，从而出现乳酸菌裂解、鲜味减退等现象；故确定最适生长温度为38 ℃。

2.3.4 接种量对石榴酵素品质的影响

由图7可以看出，随着菌种添加量增加，感官评分呈先升高后下降的趋势，在添加量为4%时，感官品质最好；菌种添加量为5%时产品感官评分略有下降，口感微甜，综合成本考虑选择菌种添加量为4%。

2.4 正交实验

从表9的极差分析可得，对石榴酵素影响的主次顺序为白砂糖添加量＞菌种添加量＞发酵时间＞发酵温度。感官评分最高组合为A2B2C2D1，正交实验所得最优组合为A3B2C1D1。因此，进行验证实验，A3B2C1D1感官评价平均分为87分，低于A2B2C2D1组合。因此，发酵石榴酵素最佳工艺为白砂糖添加量13%、发酵时间36 h、发酵温度38 ℃、菌种添加量3%。

3 结论

本研究以石榴为原料，通过单因素实验从5种乳酸菌中筛选出植物乳杆菌、乳酸片球菌、乳双歧杆菌组成复合菌种对石榴酵素进行发酵，通过均匀实验确定复合菌种接种质量比例为植物乳杆菌∶乳酸片球菌∶乳双歧杆菌=1.625∶1.250∶1.100。

通过单因素和正交实验对石榴酵素发酵工艺进行优化，确定了最佳的工艺条件为白砂糖添加量13%，发酵时间36 h，发酵温度38 ℃，菌种添加量3%，在该条件下发酵的石榴酵素颜色鲜红，口感微甜，兼具石榴和乳酸菌的风味。

参考文献

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[2]彭潇，邹文静，邵清清，等.石榴酒发酵过程中真菌种群演替及风味物质代谢规律解析[J].食品科学，2021，42（6）：157-163.

[3] VU?I? V，GRABE? M，TRCHOUNIAN A，et al.Composition and potential health benefits of pomegranate： a review[J].Current Pharmaceutical Design，2019，25（16）：1817-1827.

[4]檀茜倩，程笑笑，周振彧，等.植物酵素功能与安全性研究进展[J/OL].食品与发酵工业：1-9[2024-04-03].https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038316.

[5]尹小庆，文华英，张玉红，等.食用植物酵素中多酚类物质的研究进展[J].食品与机械，2023，39（7）：223-227.

[6]贵州省刺梨行业协会.刺梨及其制品中总酚含量的测定：T/GZCX 020—2022[S/OL].（2022-11-22）[2024-04-03]. http：//down.foodmate.net/standard/yulan.php？itemid=130343.

[7]国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中总酸的测定：GB 12456—2021[S/OL].（2021-02-22）[2024-04-03]. http：//down.foodmate.net/standard/yulan.php？itemid=97830.

[8]陶继芳，尹俊，潘海，等.均匀设计与模糊数学感官评价法优化辣椒固体饮料制备工艺[J].食品研究与开发，2023，44（10）：146-152.

[9]卢文超，白婵，熊光权，等.多级模糊数学评判法评价虾壳类调味料[J].中国调味品，2023，48（10）：39-45.

[10]刘淑婧，陈倩，敖鑫慧，等.基于正交试验与模糊综合评价优化“薄荷茶咖”配方研究[J].中国茶叶，2024，46（3）：32-35.