植物病害生防菌抗菌活性物质研究进展

谭鸿升

摘要：生防菌是一类能产生多种活性物质，从而防治植物病害的有益微生物。利用这些微生物产生的抗菌活性物质进行病害防治是未来绿色农业的发展方向。本文从抗菌物质的资源挖掘、成分种类、作用机制等方面归纳梳理了植物生防菌抗菌活性物质的研究进展，并提出该研究领域尚存在的问题及今后的研究方向，以期为进一步开展植物生防微生物资源的研究和开发利用提供理论参考。

关键词：生防菌；抗菌活性物质；资源挖掘；防病机制

中图分类号：S476 文献标志码：A

Research Progress on Antimicrobial Active Substances of Plant Disease Biocontrol Microorganisms

Abstract： Biocontrol microbe is a kind of microorganism that can produce a variety of active substances to control plant disease. Utilizing the antimicrobial active substances produced by these microorganisms for disease prevention is the future development direction of green agriculture. This paper reviewed the research progress of antimicrobial active substances from biocontrol microorganism， including resource exploration， material types， disease prevention mechanisms， etc. And we revealed the existing problems and future research directions in this research field in order to provide theoretical references for further research and development of microbial resources for plant disease biocontrol.

Keywords： Biocontrol microorganisms； antimicrobial pactive substances； resource mining； disease prevention mechanism

植物病害是影响农业生产的重要因素，全球约2/3的农作物产量损失由病害引起，致使每年至少800万人遭受饥饿威胁。传统上对于植物病害的防治主要依靠化学农药。然而随着化学农药的大量使用，植物病原菌逐渐对化学农药产生抗药性，导致施药量逐步上升，提高了植物病害的防治成本。另外，化学农药的过量使用，也会对生态环境造成破坏，还增加植物发生药害的风险。近年来，生物防治技术以其低毒、低残留、无公害等优点在防治植物病害方面显示出其独特优势[1]。植物病害的生物防治也逐渐成为研究的热点。

生物防治是一类环境友好型防治方法，主要通过利用自然环境中存在的微生物及其代谢产物来控制病害。目前已发现的生防微生物约有1000种以上，主要包括生防细菌、生防放线菌和生防真菌等[2]。直接应用生防菌活体防治植物病害往往出现田间防治效果不稳定，或防效偏低等情况。其原因在于田间环境是一个复杂的生态环境，生防菌的存活和定殖常常受到温度、湿度、紫外线等环境因子的影响。而生防菌的代谢产物，性质相对稳定，受环境影响小，目前在生产上的应用也最为成功。因此，利用微生物产生的抗菌活性物质进行植物病害防治也是最先发展起来的绿色防控模式。生防菌抗菌活性物质是指生防微生物产生的能够抑制病原菌生长、繁殖，并能干扰病原菌的生理代谢，从而使病原菌丧失活力或死亡的活性物质[3]。本文主要从植物病害生防菌抗菌活性物质的资源挖掘、分类、生防机制解析以及未来发展方向等方面进行归纳和梳理，以期为进一步开展生防微生物资源的开发和利用提供借鉴。

1 生防菌抗菌活性物质的资源挖掘与鉴定

1.1 生防细菌来源的抗菌物质挖掘

生防细菌及其代谢产物在植物病害防治中的应用最为广泛。大量研究表明，从植物的叶片、茎秆、根部及根际土壤中分离到的拮抗细菌均能产生抗菌物质。目前在抗菌物质挖掘方面研究较多的细菌主要为芽孢杆菌（Bacillus spp.）和假单胞菌（Pseudanonas spp.）。

1.1.1 芽孢杆菌产生的抗菌物质

芽孢杆菌分布广泛，不仅于土壤、植株根际等自然环境下存在，也是重要的植物内生细菌。芽孢杆菌产生的芽孢为它提供了极强的抗逆性，同时其自身还存在繁殖速度快，生长所需营养成分简单等特点，为其抗菌活性物质的挖掘提供了有利条件。目前国内外已发现多种可产生抗菌物质的芽孢杆菌属细菌，主要包括有贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensi）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）等[4]。

目前对于芽孢杆菌抗菌物质的挖掘，主要是通过LC-MS或NMR-MS技术对抗菌物质进行结构解析，然后人工合成相应结构的活性化合物；或是通过对芽孢杆菌进行全基因组测序或转录组测序筛选出能调控产生抗菌物质的功能基因，从而通过基因工程改造模式菌株获得产生抗菌物质的工程菌（表1）。REN等[5]通过NMR-MS技术鉴定淀粉芽孢杆菌SJ100001所产生的抗菌产物，鉴定结果为环脂肽类物质Epichlicin，该类物质可以通过破坏病原菌细胞壁、改变细胞膜通透性或诱导植物系统抗性（ITS）[6]的方式来对病原菌进行抑制。EDGAR等[7]利用UPLC-HRMS和SPME-GC-MS分别鉴定出了3株抗尖孢镰刀菌的贝莱斯芽孢杆菌的次级抗菌代谢产物及挥发性抗菌物质；次级抗菌代谢产物为表面活性素、伊枯草菌素和丰原素，可破坏病原真菌细胞膜导致菌丝和分生孢子的裂解；挥发性抗菌物质有酮类化合物和吡嗪类化合物，能抑制真菌生长，诱导土壤传播的植物病原真菌的细胞质膜空泡化导致菌丝变薄。枯草芽孢杆菌主要分泌出的活性物质为抗菌蛋白，ZHANG等[8]在一株枯草芽孢杆菌中分离鉴定出脂肽类物质，并对该菌株进行转录组测序，从基因层面揭示了枯草杆菌所产生的脂肽类抗菌物质的抑菌机制。ADENIJI等[9]通过对一株苏云金芽孢杆菌进行全基因组测序，从而发现并验证了苏云金芽孢杆菌可产生细菌素、几丁质酶、脂肽和Zwittermycin等抗菌物质。

1.1.2 假单胞菌产生的抗菌物质

假单胞菌（Pseudanonas sp.）是自然界中另一类常见的生防细菌，产生抗菌物质较多的主要为荧光假单胞菌（P. fluorescens）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）等（表2）。

MISHRA等[17]通过薄层色谱法（TLC）鉴定了一株荧光假单胞菌所产生的抗菌代谢产物，根据射频值判断抗菌代谢产物为2，4-二乙酰间苯三酚，该物质可影响病原真菌的孢子及菌丝的生长，拮抗菌株还可通过其PGP特性（IAA生产、增溶磷酸及锌）改善玉米的生长。李肖鹤等[18]应用NMR及ESI-MS技术对铜绿假单胞菌HBD-12抗菌代谢产物进行了鉴定，初步确定该菌株抗菌代谢产物为吩嗪类化合物，该类物质可通过抑制Aurora激酶（Aurora kinase）的活性来破坏病原菌细胞周期，使细胞增殖停滞。

1.2 生防放线菌来源的抗菌物质挖掘

放线菌的防治作用主要通过产生抗菌活性物质抑制病原菌生长来体现，多种从放线菌中获取的抗生素已经大范围应用在实际生产中，其中链霉菌（Streptomyces spp.）和诺卡氏菌（Nocardiopsis spp.）是最值得关注的生防放线菌。

1.2.1 链霉菌产生的抗菌物质

SALEHGHAMARI等[22]通过GC-MS联用鉴定了34株链霉菌中产生的抗菌代谢物质，主要包括芳姜黄酮、邻苯二甲酸异癸酯丁酯和多种酶类，这些物质表现出促进植物生长的活性，从而提升植物自身的抗病性。KUM等[23]采用基因组技术结合LC-MS技术，从链霉菌上鉴定出抗菌物质丙炔甘胺和酰胺，并通过全基因组测序验证。HE等[24]应用NMR-MS技术鉴定出了链霉菌中产生的两种抗菌代谢产物吡咯-2-羧酸和1H-吡咯-2-甲酰胺。

1.2.2 诺卡氏菌产生的抗菌物质

IBRAHIM等[25]发现拟诺卡氏菌属放线菌最常见的抗菌物质是α-吡酮和二酮哌嗪衍生物，可用于抑制病原细菌和病原真菌。WIDADA等[26]分离鉴定出两株拟诺卡氏菌，并通过GC-MS对两株诺卡氏菌的挥发性代谢物进行了鉴定，并从中发现了两种抗真菌物质——二甲基二硫及6-甲基-2-庚酮。BORAH等[27]对茶树中的内生放线菌进行了分离鉴定，并在其中发现一株拟诺卡氏菌可以产生纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等，能够降解真菌和细菌的细胞壁、细胞膜、细胞膜蛋白和细胞外毒力因子。

1.3 生防真菌来源的抗菌物质挖掘

作为生防菌的一个大类，生防真菌的开发潜力十分巨大，但是目前对于生防真菌的活性物质的研究还相对较少。已报道可产生抗菌物质的主要为木霉菌（Trichoderma spp.）和青霉菌（Penicillium spp.）等。

1.3.1 木霉属真菌产生的抗菌物质

LEYLAIE等[28]分别采用NMR和GC-MS鉴定木霉菌VM115产生的抗菌物质。NMR方法鉴定出了木霉素，GC-MS方法共鉴定出6种代谢产物，其中占比最高的是6-戊基-2-吡喃酮，并且发现木霉素主要是通过阻止肽基转移酶的活性来抑制病原菌蛋白质的生物合成。BAAZEEM等[29]对一株木霉菌FB10的抗菌物质进行GC-MS分析，同样鉴定得到了6-戊基-2-吡喃酮，还鉴定出各种碳氢化合物和游离脂肪酸。GU等[30]使用HPLC-MS和NMR技术鉴定出木霉菌的抗菌物质有Phomopsolide G、半萜类化合物、吡咯-2-甲酸和间羟基苯甲醇。

1.3.2 青霉属真菌产生的抗菌物质

WANG等[31]应用HR-ESI-MS从青霉菌中鉴定出了5种新的抗菌代谢化合物，包括2种环戊烷二萜孢子酮J和K、类固醇H、Alkaloid （Z）-4-（5-acetoxy-N-hydroxy-3-methylpent-2-enamido） butanoate和aliphatic acid （Z）-5-acetoxy-3-methylpent-2-enoic acid。BAI等[32]通过MALDI-TOF成像质谱快速研究了青霉菌对尖孢镰刀菌的抗菌物质，再对目标物质使用UPLC-MS分析鉴定，得出了3种抗菌物质，分别是琥珀酸甲酯、果糖苷A和B。NISCHITHA等[33]通过OHR LC-MS对青霉菌的抗菌物质进行了鉴定，得到主要的峰状化合物有邻苯二甲酸二辛酯和4-羟基香豆素，且在对经过青霉菌代谢物处理并接入病原菌的宿主植物代谢物鉴定中，发现了抗菌化合物甜菜碱能够抑制病原菌细胞膜合成。

2 生防菌产生的抗菌活性物质的类别

自第一个农用抗菌活性物质（灭瘟素）发现至今已有六十余年。近几十年来，新的抗菌活性物质不断被挖掘出来，目前已报道的生防菌抗菌活性物质有几百种，根据它们的活性成分和作用机制主要分为抗生素类、抗菌肽类、抑菌酶类和其它小分子物质等几个大类。

2.1 抗生素类活性物质

抗生素是最早应用于植物病害防治的抗菌活性物质，一些抗生素对植物病原菌有很强的直接抑制作用，也有一些抗生素可被植物吸收从而起到诱导系统性抗病效果。常见的抗生素包括硫酸链霉素、井冈霉素、嘧啶核苷类抗菌素、多抗霉素、春雷霉素、灭瘟素、公主岭霉素、梧宁霉素、中生菌素、武夷菌素、宁南霉素、长川霉素、嘧肽霉素和申嗪霉素等[34-36]（表3）。

2.2 抗菌肽类活性物质

抗菌肽类物质是一类具有抗菌活性的多肽物质，最早发现于昆虫体内，后来经研究发现，细菌也可以产生抗菌肽。生防细菌中以芽孢杆菌属和假单胞菌属产生的抗菌肽最为常见。目前在生防细菌中已发现的抗菌肽有杆菌肽（Bacitracin）、短杆菌肽S（Gramicidin S）、多粘菌素E（Polymyxin E）和乳链菌肽（Nisin）等[37-38]。

2.3 酶类活性物质

生防菌可以通过分泌酶活性物质对病原菌细胞壁或细胞膜的生成物质进行分解，从而破坏病原菌的结构，或间接提高其他抗菌产物活性，从而抑制病原菌生长，控制病原菌的数量。常见的生防菌抗菌代谢酶有几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、果胶酶、转氨酶、过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和木聚糖酶等[39-41]。

2.4 其它小分子抗菌活性物质

除以上三大类抗菌活性物质外，近年来还在生防菌代谢产物的研究中发现了新的抗菌活性物质，如酚类化合物、酮类化合物、吡嗪类化合物、哌啶类化合物、脂肪酸、萜类化合物[42-44]等小分子化合物。

3 生防菌抗菌活性物质的生防机制解析

对生防菌抗菌活性物质生防机制的探讨，有助于人们掌握各种代谢产物的防病特点、作用靶标和活性位点等，可为更好的利用这些活性物质提供理论指导。四大类活性物质的作用机制既有相似之处，也有各自独特途径。

3.1 抗生素类物质的生防机制

生防菌中抗生素类物质多由放线菌中的链霉菌及细菌中的假单胞菌产生。抗生素类物质对植物病原菌的作用机制主要体现在四个方面：第一，抑制细菌细胞壁的合成，导致病原细菌细胞破裂死亡；第二，病原菌细胞的细胞膜受到一些抗生素的作用，影响了膜的渗透性；第三，抑制核酸的功能使病原菌细胞分裂及所需酶的合成过程停滞，并控制病原菌对植物毒力因子的产生[45]；第四，存在光敏化合物，能够在光照强度足够的情况下增强自身抗菌效果。

3.2 抗菌肽类物质的生防机制

生防菌中的抗菌肽类物质多为芽孢杆菌属和假单胞菌属两类细菌代谢产生，抗菌肽自身具有双亲性，可通过在细胞膜靶位点上进行作用，在膜孔处产生通道，使细胞结构出现破损，引发大量细胞质溢出从而令细菌消亡。还可通过胞内损伤机理表现出自身的抗病作用，即抗菌肽可以不受阻拦的穿过精氨酸的铰链区，直接穿过通透性未表现出变化的细胞膜，贮藏在病原细菌细胞中，参与 DNA、RNA 及蛋白质的合成或翻译，从而抑制膜蛋白的合成，使细胞膜完整性受损，导致细菌细胞的破损或消亡[46]。

抗菌肽类物质根据合成途径可以分为非核糖体抗菌肽和核糖体抗菌肽。非核糖体抗菌肽中根据结构差异还可以主要分为表面活性素、伊枯草菌素和丰原素[47]。表面活性素具有双亲性，能够作为助剂与叶面肥混合，诱导抗病性和促进植物生长。伊枯草菌素可以通过破坏菌体细胞壁、细胞膜及使膜通透性发生改变等作用方式对病原菌进行抑制。丰原素则可以通过抑制病原菌菌丝生长、改变菌丝形态、抑制产孢、使病原菌细胞壁完整性受损，改变病原菌细胞膜的通透性等方式，进而导致病原菌的定殖能力及侵染能力降低[48]。核糖体抗菌肽统称为细菌素，其杀菌机制主要是引起细菌细胞膜出现微孔，使细胞内部含有的离子溢出，消耗了质子驱动势，最终导致病原菌消亡[49]。

3.3 酶类物质的生防机制

生防菌可通过产生酶对病原菌的生长过程或对植物生长过程产生影响。如几丁质酶可以通过分解病原菌细胞壁中的几丁质成分，从而破坏细胞壁的完整性，杀死病原菌[50]。β-1，3-葡聚糖酶能够消解细胞壁β-1，3-葡聚糖糖链，致使病原菌菌丝发生断裂或畸形，造成病原真菌胞内原生质泄漏，同时抑制其孢子产生。此外，这一过程还可以引导真菌细胞壁放出碎片诱导物，诱发植物免疫反应，间接促进寄主植物自身植保素的积累，提升植物自身的抗病能力。漆酶通过对木质素单体聚合进行催化的方式，成为植物次生细胞壁形成过程中的成员，促进植物的生长发育。

3.4 其它小分子抗菌物质的生防机制

近年来对于生防菌生防机制的研究逐渐增多，挖掘出的抗菌活性物质也不再仅限于上述三大类。研究发现酚类化合物可以通过抑制细菌细胞壁中肽聚糖的合成，致使其细胞壁降解进而使细菌失去屏障保护功能，破坏细胞壁的完整性，从而影响细菌正常形态[16]；也可以改变细胞膜的通透性，阻碍菌株的能量代谢及蛋白质合成，达到抑菌的作用；还能通过螯合环境中铁的消耗来抑制病原菌的生长[51]。酮类化合物可使细胞内蛋白流出导致菌体死亡。脂肪酸可使细胞膜疏水区域的相邻脂酰链溶解，使病原菌外层膜出现破损，从而增加细胞膜的渗透性，还能使病原菌鞭毛脱落[43]。

4 问题与展望

植物病害的生物防治是未来绿色农业发展的方向，相较于活体生防菌，微生物的抗菌活性产物在自然环境中更稳定，也更易开发成生物农药产品，将更快在生产上推广应用。但目前对生防菌产生的抗菌活性物质的研究，尚存在一些不足。首先，从活性物质的微生物来源看，仍需要进一步发掘产生抗菌物质新的生防菌种类。目前抗菌物质的来源还主要局限在可培养微生物中，如：芽孢杆菌、假单胞菌等生防细菌，链霉菌、拟诺卡氏菌等生防放线菌，以及木霉、青霉等生防真菌。对自然环境中存在的大量不可培养微生物的抗菌活性物质的研究非常缺乏。其次，从活性物质的挖掘手段来看，对新技术新工具的应用略显滞后。目前挖掘和鉴定抗菌物质还主要采用层析色谱、高效液相等化学手段，而采用基因组、蛋白组、代谢组等多组学的分子生物学手段较少。再次，从已发现的抗菌活性物质类别来看，仍需要进一步发掘新的抗菌物质种类。目前已报道的抗菌物质主要以的抗生素、抗菌肽以及酚酮萜等小分子物质为主，蛋白类的大分子物质较少。小分子物质对病菌的作用靶点往往较为单一，仍存在病原菌产生抗药性的风险。而大分子的蛋白往往同时具有多个作用靶点，由蛋白类物质开发出的生物农药产品将具有更长的市场寿命。最后，对于抗菌活性物质抑菌防病作用机制的研究，仍不够深入。主要表现在，一是研究水平仍主要集中在细胞水平，基因水平的研究较少；二是研究角度仍主要从单细胞角度开展研究，在对微生物群落的群体感应的机制研究较少。

综上，我们提出未来抗菌活性物质研究的几点建议。第一，借助高通量测序手段，结合传统化学方法，进一步从新的微生物类群中挖掘潜在的新型抗菌物质。尤其是不可培养微生物中的抗菌物质资源特别值得重视。随着新一代测序技术的发展，依靠传统分离方法不能研究的生防菌，依托基因组大数据有望从中发掘出更多新颖的抗菌物质。第二，进一步加深抗菌活性物质生防机制的研究。综合运用基因组、转录组、蛋白组和代谢组等多组学手段深入解析各类生防菌抗菌活性物质的合成通路，以及调控这些代谢产物的分子机制。挖掘新的抗菌物质合成功能基因，用于工程菌的改造与设计。第三，加强抗菌物质加工生产工艺和剂型的研究。抗菌物质田间防病效果的发挥，除了与物质本身的活性有关外，还取决于该物质能否在自然环境中维持性质稳定，能否在植物表面大量附着，能否在土壤中快速渗透等多种因素。这就需要通过改良生产工艺，筛选合适的助剂，提高防治效果。总之，抗菌活性物质是自然界馈赠给人类的绿色农药资源，利用好这些活性物质，将会给未来农业的可持续发展带来新的生机。

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