作物病原真菌的拮抗菌筛选及其活性物质初步鉴定

胡洪涛+张亚妮+张舒+李金泉+张佑宏+汪本福+曹春霞+任淑惠+朱志刚+姚经武+龙同+黄大野+杨自文

摘要：从湖北、安徽等地的水稻、小麦、豇豆、西瓜等种植区采集土壤，进行了微生物分离和培养。采用对峙培养法，筛选到20株对11种重要作物病原真菌，如水稻稻瘟菌、小麦赤霉菌、豇豆根腐菌、西瓜枯萎菌等，具有不同拮抗活性的细菌，其中2株具有广谱抗真菌活性。利用高效液相色谱和质谱对其中一株菌株的代谢产物进行了制备和结构初步鉴定，发现其主要活性成分为多烯类物质，分子量为803.67。继续深入研究抗菌物质结构和抑菌机理，将有助于新型生物源杀菌剂的开发。

关键词：生防菌；稻瘟菌；赤霉菌；抑菌活性；高效液相色谱；质谱

中图分类号：S476

文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2017）23-0164-04

1 引言

作物真菌性病害，如水稻稻瘟病（Rice blast）、小麦赤霉病（Fusarium head blight）、西瓜枯萎病（Fusarium wilt of watermelon）、豇豆根腐病（Cowpea root rot）等，是世界性重要作物病害，全球每年仅因稻瘟病和赤霉病流行导致的经济损失就高达数十亿美元^[1，3]，同时，赤霉菌所产生的真菌毒素严重威胁着食品安全^[4]；西瓜枯萎病和豇豆根腐病是重要土传性病害，常导致西瓜和豇豆大面积死亡。目前，防治真菌性病害的方法众多，但多以化学药剂防效最好，然而，化学药剂大量施用，不仅导致农药残留超标，也给环境和食品安全带来极大隐患。生物农药环境兼容性好、对生物安全，是作物病害绿色防控技术体系的关键。供药筛选的化合物主要由3种获取途径，购买已知化合物库、分离和提取天然产物以及化学合成，其中微生物来源的天然产物因其种类众多、易扩大和再生，而成为药物开发的最主要来源^[5]。由于前人研究多关注放线菌和真菌，因而在过去所发现的2万多种微生物来源的活性物质中，绝大部分来源于放线菌和真菌^[5]，只有小部分约7%来源于细菌，说明细菌来源的活性物质亟待研究和开发。目前，针对作物真菌病害的生物防治研究，多限于微生物本身，很少涉及到微生物代谢产物，对其活性成分研究更少^[6]。通过在大田采取土样，进行细菌分离、纯化，对具有较好拮抗作用的菌株进行大量发酵，并提取其代谢产物，利用高效液相色谱和液质联用仪进行化合物制备和结构初步鉴定，为开发新型生物源农药奠定基础。

2 材料与方法

2.1 供试作物病原真菌

稻瘟菌（Magnaporthe grisea）为湖北省农业科学院植保土肥所研究所提供，小麦赤霉菌（Fusarium graminearum）、茄科立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、棉黄萎菌（Verticillium dahliae）、柑橘褐腐（Fusarium spp.）、柑橘黑腐菌（未定种）、柑橘绿霉（Penicillium digitatum）、柑橘青霉（Penicillium italicum）、豇豆根腐菌（Fusarium solani）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxsporum）為湖北省生物农药工程研究中心生物防控研究室分离和保存。

2.2 土壤细菌分离

用于分离土壤细菌的土壤，2016年采集于湖北武汉和宜城，及安徽铜陵等地水稻、小麦、豇豆、西瓜等大田，采用稀释法进行土壤细菌分离。首先，称取1.0 g 左右土壤，放入装有玻璃珠的消毒三角瓶，然后，加入100 mL 无菌水，置于摇床（28 ℃，150 r/min）振荡15 min，采用倍比稀释法进行稀释，每个浓度取100 μL，用涂布棒在NA平板上均匀涂布，置于28 ℃培养箱进行培养24～48 h，挑取单菌落进行二次划线纯化，经镜检无杂菌后，-80 ℃保存于25%甘油管中。

2.3 作物病原真菌拮抗菌初筛

将供试保存的病原真菌在真菌培养基上活化3～5 d，用直径为5 mm 打孔器沿菌落边缘打成菌丝块，将菌丝块转移至新真菌培养基平板中央，然后，将待测细菌接种于离菌丝块15 mm 左右的地方，于26 ℃培养3～5 d后，测量和记录抑菌圈大小。

2.4 拮抗菌代谢产物提取

拮抗细菌在NA平板上活化24 h，接种于NA液体培养基的带挡板的500 mL三角瓶，每瓶培养基体积为50 mL，共接种20瓶，摇床振荡（28 ℃，150 r/min）培养48 h后，每瓶加入等体积的乙酸乙酯，摇床振荡（28 ℃，150 r/min）2 h，然后，静置直至完全分层。将上清小心吸出，采用旋转蒸发仪（45 ℃，100 Pa）将其蒸干，产物用甲醇溶解后，用于高效液相色谱（HPLC）制备和液质联用仪（LC-MASS）分析。

2.5 代谢产物HPLC制备

采用高效制备液相色谱仪（Waters2525泵，带2767自动收集系统，2996二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4.0）进行拮抗菌代谢产物制备。色谱柱为美国SunfireOBD C18 Prep 柱，250×19 mm（i.d），粒径10 μm；柱温为室温；流动相：A为 水，B为乙腈（梯度洗脱）；进样量为3000 μL；流速为27 mL/min； 检测条件：PDA全波长扫描。

进样体积为1000 μL，柱温为室温，流速为24 mL/min，流动相为乙腈和水，采用表1梯度洗脱，乙腈的浓度在 25 min内由5%变至100%。每0.5 min收集一个组份，用干净空气吹干后进行生物活性测定，确定活性成分分布位置（表1）。

2.6 活性物质LC-MASS分析

高效液相色谱-质谱联用仪为Waters 2695高效液相色谱系统，美国Micromass Quattro micro质谱仪（电喷雾离子源（ESI）），Masslynx V4.1液质联用分析软件。质谱检测条件：电喷雾电离（ESI），毛细管电压为3.5 kV，锥孔电压为45 V，离子源温度为100 ℃，脱溶剂气温度为 300 ℃，脱溶剂气体流速500 L/h，锥孔气体流速为50 L/h。endprint