防治脐橙炭疽病生防菌的筛选

张晓媛+赖闻玲+许杨

摘要：采用杯碟法测定枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、木霉菌（Trichodermaspp）、瓦克青霉（Penicillium waksmanii）、白浅灰链霉菌（Streptomyces albo-griseolus）对脐橙炭疽病病原菌菌株GXA5-1的防治效果。试验结果显示，白浅灰链霉菌抑制菌丝体生长的效果最显著，在不同稀释度下的相对抑制率都是最大的，稀释10、100、200倍的相对抑制率为96.31%、85.82%、62.69%。枯草芽孢杆菌抑制孢子萌发的效果是最显著的，稀释10、100、200倍的相对抑制率分别为89.93%、67.59%、48.76%。

关键词：脐橙炭疽病；生防菌；生物防治

中图分类号：S436.661.14 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0152—02

炭疽病是严重危害农作物生产和农产品储运的一大真菌性病害，具有危害广和危害时间长的特点，主要侵害农作物叶片、枝条、花、果实和果柄，常造大量落叶、枝条枯死、落花、落果和果实腐烂。炭疽病的病原菌因植物不同而有所不同，主要由半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目炭疽菌属（Colletotrichum）中的真菌引起。炭疽病病原一般可直接在寄主上产生无性繁殖阶段，而有性繁殖阶段则很少见到。

引起柑橘炭疽病的病原菌无性阶段是半知菌亚门炭疽菌属的胶孢炭疽菌（CoUetotrichum gleosporioides Penz），有性阶段为子囊菌门小丛壳属（Glomerella cingulata Stonem），该病菌寄主范围广，能侵害多种热带、亚热带和温带农产品品种。在很多情况下炭疽病是多种病原菌相互作用引起的，例如c.gloeosporioides、C.acutatum和C.fragariae引起草莓炭疽病。

目前，防治炭疽病主要依靠化学药物。众所周知化学杀菌剂的长期泛滥使用，极易增强病原菌的耐药性。根据美国加利福尼亚的调查，抑霉唑在柑橘上连续使用5年以后，出现了抗抑霉唑菌株指状青霉。化学杀菌剂的滥用造成土壤、空气的二次污染及农产品中的残留农药超标，再次威胁环境和人类健康。因此植物炭疽病的防治研究开始转到生物技术应用上来。部分用于防治农产品采后炭疽病害的安全有效的生物制剂已经研发出来，国内外对拮抗菌筛选及采后果害的研究也取得了一定的成果。但是在柑橘属农产品上，至今尚未发现能抑制炭疽病菌达12 h以上的生物杀菌剂。本研究立足于地方脐橙产业中炭疽病害频发现状，旨在筛选出经济、安全、高效的抑菌菌株，为进一步进行田间试验和微生物农药的选育提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1培养基 细菌培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH值7.0～7.2，121℃灭菌20 min）。真菌培养基采用PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，121℃灭菌20 min）。

1.1.2供试菌株 炭疽病致病菌株GXA5-1，分离自江西省赣州市赣县梅林果园脐橙炭疽病发病病叶。按照科赫氏法则完成病原菌的分离纯化、鉴定及致病性测定，确认为胶孢炭疽菌。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluores-cens）、木霉菌（Trichodermaspp）、瓦克青霉（Penicillium waks-manii）、白浅灰链霉菌（Streptomyces albogriseolus）购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3生防菌处理液的制备 枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、荧光假单胞菌于100 mL牛肉膏液体培养基37℃、150 r/min振荡活化12 h，取菌液5 mL加至95 mL牛肉膏液体培养基中，37℃、150 r/min振荡培养，浑浊后以4 000 r/min离心10 min，取上清备用。

木霉菌、瓦克青霉接种至查彼固体培养基，25℃培养3 d，再转接至液体培养基，25℃、150 r/min振荡培养，出现大量菌丝后过滤，4000 r/min离心10 min，取上清备用。

白浅灰链霉菌接种至高氏一号固体培养基，28℃活化培养2 d，再转接至液体培养基，28℃、150 r/min振荡培养，浑浊后以4 000 r/min离心10 min，取上清备用。

1.1.4菌株处理液对脐橙炭疽病病原菌菌丝生长的影响采用杯碟法，配制含有生防菌处理液的PDA平板，稀释度为10、100、200倍。直径4 mm的打孔器切取菌块，移植至含有生防菌处理液的PDA平板中央，28℃下培养。3 d后测量菌落直径，记录生长情况。不含处理液的PDA平板，作为对照。每个菌株做3次重复，计算相对抑制率。

1.1.5菌株处理液对脐橙炭疽病病原菌孢子萌发的影响制备浓度为5×10⁴个/mL的孢子悬浮液。将生防菌处理液和孢子悬浮液稀释10、100、200倍，滴在无菌凹玻片上，28℃保湿培养18 h后镜检，3次重复，无菌水做对照。每处理500个孢子，计算孢子萌发率和抑制率。

2结果与分析

2.1不同生防菌处理液对脐橙炭疽GXA5-1菌丝生长的抑制作用

从表1可以看出，在相同浓度下，各生防菌对病原菌的生长影响表现有显著性差异，白浅灰链霉菌的抑制效果最显著，在不同稀释度下的相对抑制率都是最大的。细菌中苏云金芽孢杆菌的防治效果不明显，枯草芽孢杆菌的防治效果较显著。苏云金芽孢杆菌比其他生防菌的抑制率都低，在稀释10倍时抑制率为42.69%。相同生防菌菌株随着浓度下降，对病原菌菌丝生长的抑制率也下降。

2.2不同生防菌处理液对脐橙炭疽GXA5-1孢子的抑制作用

从表2可以看出，在相同浓度下各生防菌对分生孢子萌发影响差异显著，其中枯草芽孢杆菌在不同稀释度下的相对抑制率都是最大的，而苏云金芽孢杆菌的抑制效果不明显，当稀释度为10倍时苏云金芽孢杆菌的抑制率为36.49%。相同生防菌菌株随着浓度的下降对孢子萌发的抑制率也下降。

3讨论

采用杯碟法测定枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、荧光假单孢菌、木霉菌、瓦克青霉、白浅灰链霉菌5种生防菌对菌株GXA5-1的抑制效果。試验结果显示白浅灰链霉菌抑制菌丝体生长的效果最显著，在不同稀释度下的相对抑制率都是最大的，稀释10、100、200倍的相对抑制率分别为96.31%、85.82%、62.69%。枯草芽孢杆菌抑制孢子萌发的效果是最显著的，稀释10、100、200倍的相对抑制率分别为89.93%、67.59%、48.76%。

生防菌防治植物病害防效是植物体、病原菌和杀菌剂共同作用的结果，生防菌对脐橙炭疽病病原菌的生防机理呈多样性，包括竞争作用、抑菌作用和诱导植物抗性等。在室内毒力测定中，主要是生防菌分泌抗菌物质抑制病原菌生长。如枯草芽孢杆菌产生抗菌素伊枯草素（iturin）能有效防治植物腐烂病，丁香假单胞杆菌产生丁香素防治柠檬绿霉病。当然防效是依靠多种机制协同作用，目前还没有发现单一机制决定生物防效的生防菌。

本研究结果显示，生防菌抑制率受有效浓度直接影响，随着试验浓度下降，抑制率也下降很快。而在大田生产中，生防菌有效浓度受阳光、气温、湿度及土壤营养条件等自然环境因素影响较大，因此生防菌的不稳定性成为目前生物农药研发的最大阻碍。

虽然目前生防菌的防治机理研究不够深入，在大田生产中对自然环境依赖性强故而导致对植物病害的防治效果不如化学药物，但是从环境影响和安全的角度考虑，选育高效生防菌替代化学药物防治植物病害是今后生物农药开发的热点。