叶下珠黄化植原体和丛枝植原体的分子鉴定

林兆威　牛晓庆　唐庆华　王晔楠　孟秀利　宋薇薇

关键词：叶下珠；黄化；丛枝；植原体；分子鉴定

中图分类号：S763.7 文献标志码：A

叶下珠（Phyllanthus urinaria L.），又名珍珠草、夜合草，是大戟科（Euphorbiaceae Juss）叶下珠属（Phyllanthus）一年生草本植物。在我国主要分布于广西、广东及海南等南方地区。带根全草可入药，具有很高的药用价值。研究发现，叶下珠在抗乙肝病毒（HBV）、抗肿瘤、抗菌、抗内毒素、抗血栓形成及免疫调剂等方面具有较好的药理作用[1]。近年来，叶下珠常用于临床上抗HBV 的研究，对乙型肝炎的治疗有巨大的开发潜力。

植原体（phytoplasma）是存在于植物韧皮部的筛管细胞及介体昆虫的肠道、淋巴及唾液腺等组织内的一类专性菌，主要通过刺吸式介体昆虫进行植物间传播。被植原体侵染的植物常引起丛枝、叶片黄化、花变叶及矮化等症状[2]。至今已有1000 余种植物被植原体侵染，我国已报道100多种植原体病害[3-4] ， 其中枣疯病（ jujubewitches-broom， JWB）[5]、小麦蓝矮病（wheat bluedwarf disease， WBD）[6]、甘蔗白叶病（sugarcanewhite leaf， SCWL）[7]及泡桐丛枝病（paulowniawitches-broom， PaWB）[8]等危害严重，对相关产业造成严重的经济损失。在海南，植原体侵染引起的槟榔黄化病（areca palm yellow leaf disease，YLD）是一种毁灭性病害[9]，每年因该病造成的经济损失高达20 亿元以上[10]。

2022 年8 月，本研究团队在海南省文昌市文城镇的1 个槟榔园内进行黄化病调查，发现该园有叶片表现黄化的叶下珠和1 株表现丛枝的叶下珠，为典型的植原体侵染引起的症状。前期采用荧光定量PCR 检测技术（专利申请号：202210933142.8），对叶下珠黄化和丛枝2 种症状进行植原体检测，结果发现2 种症状均显示植原体阳性，且病原含量分别为6.8×10³、4.6×10⁸copies/μL。目前国内外尚无叶下珠黄化植原体和丛枝植原体分类鉴定的相关报道，因此，本研究分别对叶下珠黄化、丛枝植原体16S rDNA 基因和核糖體蛋白基因（rp）进行克隆，通过分子鉴定的手段明确叶下珠黄化植原体和丛枝植原体的分类地位，并与槟榔黄化植原体16S rDNA 进行分析，为槟榔黄化病中间寄主的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 待测叶下珠黄化、丛枝样品采自海南省文昌市文城镇（19°33′13″N， 110°47′14″E）。叶下珠黄化症状表现为整株黄化，主要为叶肉黄化，叶肉叶脉黄绿相间明显，后期发展为叶肉叶脉黄化（图1A～图1D），该样品编号为HN-Pu2；叶下珠丛枝症状表现为整株丛枝，叶片变小（图1E～图1F），该样品编号为HN-Pu1；健康样品（图1G ） 采自海南省文昌市文城镇（ 19°33′14″N，110°47′15″E）。

1.1.2 主要试剂与仪器 pMD18-T 载体购自TaKaRa 公司；2×Taq PCR Mix、植物基因组DNA提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒购自TIANGEN 公司；DH5α 感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。主要仪器：1～1000 μL 移液器、GD120 恒温水浴锅、5810R 离心机及BiometraTOne 96G 梯度PCR 等。

1.2 方法

1.2.1 叶下珠叶片总DNA 提取 剪取叶片样品0.1 g，参照植物基因组DNA 提取试剂盒说明书，进行样品DNA提取，并将提取的DNA置于–20 ℃中保存，备用。

1.2.2 16S rDNA 和rp 基因的PCR 扩增 以待测样品叶片总DNA 为模板，健康样品为阴性对照，H₂O 为空白对照进行PCR 扩增。采用巢氏PCR技术检测叶下珠黄化的植原体，采用一步PCR 检测叶下珠丛枝的植原体。16S rDNA 和rp 基因扩增引物序列见表1，16S rDNA 基因的巢氏PCR扩增的第1 步反应引物为P1/P7，第2 步反应引物为R16F2n/R16R2；rp 基因的巢氏PCR 扩增的第1 步反应引物为rpF1/rpR1，第2 步反应引物为rpF2/rpR2；其中，巢氏PCR 第1 步反应结束后，需将PCR 产物稀释50 倍作为模板进行第2 步反应。所需引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，DNA 模板为2.0 μL，ddH₂O 为8.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL。引物P1/P7 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。引物R16F2n/R16R2 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。rp 基因的引物rpF1/rpR1 和rpF2/rpR2 扩增程序参照林兆威等[11]的方法。

1.2.3 PCR 产物纯化、克隆及序列测定 经琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物的目标条带进行回收纯化，并将目的片段与pMD18-T 载体连接后转至DH5α 感受态细胞中，在抗生素平板中进行涂板于37 ℃培养，通过菌落PCR 进行阳性验证，将阳性转化子送深圳华大基因股份有限公司测序。

1.2.4 16S rDNA 和rp 基因序列一致性及系统发育树分析 经测序获得的16S rDNA 和rp 基因通过NCBI 在线blastn 程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行同源性检索分析，在GenBank 数据库中下载不同组或亚组的代表性植原体16 rDNA基因序列和rp 基因序列，利用MEGA 7.0 软件，采用邻接法（neighbor joining），bootstrap 复数设置为1000，分别构建16S rDNA 和rp 基因的系统发育进化树，分析叶下珠黄化植原体和丛枝植原体分类地位，并将16S rDNA 和rp 基因序列提交至GenBank 数据库。

1.2.5 植原体16S rDNA 序列虚拟RFLP 分析叶下珠黄化植原体和丛枝植原体的16S rDNA 基因通过植原体在线分类鉴定软件iPhyClassifier（ https：//plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi）进行相似性分析和虚拟RFLP 分析，确定植原体的分类地位[16]。

2 结果与分析

2.1 植原体16S rDNA 和rp 基因片段的获得

从叶下珠黄化样品中扩增植原体16S rDNA基因，获得约1.2 kb 的片段；扩增rp 基因，获得约1.2 kb 的片段。从叶下珠丛枝样品中扩增植原体16S rDNA 基因，获得约1.8 kb 的片段；扩增rp 基因，获得约1.2 kb 的片段（图2）。获得的片段大小均与预期目的片段大小基本一致，且健康样品和ddH₂O 中未扩增出相应片段。将以上片段进行测序比对，结果为植原体，因此将该叶下珠黄化和丛枝植原体分别暂命名为叶下珠黄化植原体海南株系（PuY-HN-2022）、叶下珠丛枝植原体海南株系（PuWB-HN-2022）。

2.2 16S rDNA、rp 基因序列一致性及系统发育树分析

通过克隆基因目的片段，获得叶下珠黄化植原体16S rDNA 片段1246 bp（登录号：OP851691），rp 基因片段1212 bp（登录号：OP918672）；叶下珠丛枝植原体16S rDNA 片段1827 bp（登录号：OP850851）， rp 基因片段1240 bp（登录号：OP918671）。经基因序列一致性分析，叶下珠黄化植原体和丛枝植原体与16SrⅠ组植原体的16SrDNA 序列一致性高达98%以上。其中，叶下珠黄化植原体与欧洲油菜矮缩植原体（登录号：MG599470.1）的16S rDNA 序列一致性达100%；叶下珠丛枝植原体与多毡毛苎麻丛枝植原体（登录号：MT708485.1）、柳叶菜花变叶植原体（登录号：AY101386.1）的16S rDNA 序列一致性达99.84%；二者均与槟榔黄化植原体海南株系（登录号：MZ971180.1）的16S rDNA 序列一致性达100%。叶下珠黄化植原体、丛枝植原体的rp 基因序列均与rpⅠ组的植原体一致性高达99%以上，且与洋葱簇生植原体（登录号：GU228514.1）一致性达100%。经系统发育树分析，叶下珠黄化植原体和丛枝原体16S rDNA 基因均与翠菊黄化组（16SrⅠ）植原体聚于一个大分支，且与16SrⅠ -B 亚组的槟榔黄化植原体（ 登录号：MZ971180.1）聚于同一个小分支，亲缘关系接近；与其他组植原体亲缘关系较远（图3）。叶下珠黄化植原体和丛枝植原体rp 基因均与翠菊黄化组（rpⅠ）植原体聚于一个大分支，且与rpⅠ-B 亚组的翠菊黄化植原体（登录号：AY183708.1）聚于同一个小分支，亲缘关系接近；与其他组植原体亲缘关系较远（图4）。根据2004 年比较支原体学国际研究规划（International Research Projectfor Comparative Mycoplasmology， IRPCM）对植原体暂定种的划分规则[17]，叶下珠黄化植原体和丛枝植原体划为16SrⅠ组。

2.3 虚拟RFLP 分析

将叶下珠黄化植原体和丛枝植原体的16SrDNA 基因序列进行虚拟限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，获得的图谱与16SrⅠ-B 的洋葱黄化植原体（登录号：AP006628）的参考图谱相同（图5），且相似系数为1.00。综上，该叶下珠黄化植原体海南株系和叶下珠丛枝植原体海南株系均属于16SrⅠ-B 亚组成员。

3 讨论

由于植原体极难人工分离培养，在植原体的分类鉴定上难以通过形态观察、生理生化指标进行分类鉴定，通常采用16S rDNA 基因、rp 基因及tuf 基因等植原体保守序列进行一致性比较，且植原体的组/ 亚组的划分标准依据为引物R16F2n/R16R2 扩增16S rDNA 基因序列的17 种限制性内切酶的RFLP 分析[18-19]。本研究通过克隆植原体16S rDNA 和rp 基因，并对基因序列进行一致性分析、系统发育树分析及16S rDNA 虚拟RFLP 分析，将叶下珠黄化植原体海南株系和叶下珠丛枝植原体海南株系鉴定为16SrⅠ-B 亚组成员。目前关于叶下珠属植物受植原体侵染为害的报道较少，本文为首次报道植原体侵染为害叶下珠。本研究发现，叶下珠均受16SrⅠ-B 亚组的植原体侵染，但表现出不同的症状，在前期的植原体检测中发现这2 種症状的植原体含量有数量级的差异。因此推测，导致叶下珠表现不同症状的原因与植原体侵染的含量差异有关。

在植原体的各组中，16SrⅠ组成员最多，为29 个亚组[20]，16SrⅠ-B 亚组是翠菊黄化组植原体中寄主范围最广的亚组之一。其中，16SrⅠ-B 亚组的植原体侵染引起的槟榔黄化病在海南省发生面积占27.89%，对海南槟榔产量造成严重损失[21]。YU 等[22-23]研究发现，槟榔黄化植原体株系与细圆藤丛枝植原体、辣椒黄化皱缩植原体的亲缘关系很近，同源性可达100%，并推测细圆藤[Pericampylusglaucus （Lam.） Merr.]和辣椒（Capsicum annuumL.）可能是槟榔黄化植原体的中间寄主。本研究发现，叶下珠黄化植原体和丛枝植原体的16SrDNA 基因序列与槟榔黄化病植原体海南株系16S rDNA 基因序列（登录号：MZ971180.1）的一致性达100%；在系统发育树中，与槟榔黄化植原体的亲缘关系接近；本研究团队前期对该槟榔园进行槟榔黄化病检测时，发现该园的黄化病发生率高，叶下珠黄化和丛枝的发生也在该槟榔园内，因此，是否由感染黄化病槟榔作为传染源引起叶下珠感染将作进一步研究。另外，植原体通常通过刺吸式介体昆虫传播[24-25]，目前发现槟榔园中椰子坚蚜、长尾粉蚧、黑刺粉虱、蓟马、棘缘蝽、白盾蚧6 种昆虫携带植原体[26]，因此，叶下珠是否会成为槟榔黄化病通过媒介昆虫传播的中间寄主也将作进一步研究。

叶下珠是海南农田、林地常见的草本植物，经上述分析，叶下珠可能是槟榔黄化病田间的中间寄主。植原体寄主的多样性可能会有利于同组或亚组的植原体适应不同的环境，或将不同的寄主植物作为中间介体促进植原体的传播与病害的流行[27-28]。因此，在槟榔黄化病的防控中，不但要切断媒介昆虫的传播，也应铲除中间寄主作为传播途径的毒源。