定植早期多效唑处理对甘薯块根发育及其蔗糖代谢的影响

赵添　辛曙丽　黄哲瑞　刘永华　朱国鹏

关键词：甘薯；多效唑；蔗糖代谢；蔗糖分解酶；块根发育

中图分类号：S531 文献标志码：A

甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]属旋花科一年生或多年生草本植物，其块根富含淀粉、可溶性糖、膳食纤维、蛋白质、维生素、矿物质以及多酚、多糖、花青素等活性成分，是我国重要的粮食、经济、工业原料作物[1-2]。据联合国粮农组织（FAO）最新数据显示，2020 年我国甘薯种植面积为225 万hm²，约占全世界种植面积的30.27%，总产量为4920 万t，约占全世界总产量的54.97%，稳居世界首位[3]。虽然我国甘薯种植面积和总产量极大，但平均单产较前20 年的数据相比，并未进一步提升，一直徘徊在22 t/hm²左右，和发达国家相比仍有一定差距[3]。同时，甘薯品质相较发达国家也有待提升，特别是我国甘薯的淀粉和干物质含量均相对较低[4]。

多效唑（paclobutrazol，PBZ）作为具有生长调节作用的三氮唑类化合物之一，在农业上广泛应用[5]。对块根/块茎类作物施加PBZ，可抑制茎叶的生长，增加其根冠比，促进光合同化产物向作物产品器官的分配，从而增加产量，如火葱的鳞茎[6]、马铃薯的块茎[7-8]、胡萝卜的直根等[9]。此外，PBZ 还可促进叶绿体分化，促进叶绿素的生物合成，防止叶绿素降解，从而提高光合速率，达到增产的效果[10-11]。甘薯生产上常发生因茎叶徒长而导致产量下降的现象，而喷施PBZ 也可有效抑制茎叶徒长，从而增加块根产量[11-12]。除了增加产量外，施用PBZ 还可以提高甘薯块根的品质。如PBZ 处理可将甘薯块根的淀粉含量提高42%[13]；此外，PBZ 处理还会提高块根中的蛋白质含量和淀粉的崩解值，有利于改善甘薯的食味[11]。

甘薯产量的形成主要受到单株结薯数和单薯重的影响。研究表明，PBZ 处理可显著提高单薯重和结薯数2 种指标中的一种或2 种来增加甘薯产量。例如，在正常栽培条件下，封垄期进行PBZ处理可通过增加单薯重来提高甘薯品种北京553块根产量，但对单株结薯数无显著影响[13]。同样在品种北京553 上，封垄期（定植后46 d）的高浓度PBZ 处理虽然显著提高了甘薯结薯数，但却导致单薯重出现轻微下降[14]。此外，定植后50 d的PBZ 处理不但提高济薯25 的单薯重，而且还显著增加其结薯数[15]。目前有关PBZ 提升块根/块茎类作物产量和品质的研究主要集中在马铃薯上，对甘薯的研究相对较少，尚不清楚PBZ 影响单薯重、结薯数以及淀粉含量的生理生化机制。

植物光合产生的蔗糖不仅是合成淀粉的原料，其分解产生的己糖还可作为糖信号调控各种新陈代谢过程和植物器官（包括块根/块茎）的生长发育[16]。在蔗糖代谢过程中，蔗糖分解酶扮演着重要角色，当蔗糖从叶片运输到库器官（如种子、果实和块根/块茎）后，首先被蔗糖分解酶分解为己糖或己糖衍生物，然后再用于淀粉的合成和其他各种生物代谢过程[16]。在植物体内蔗糖分解酶共有两大类，分别为蔗糖合成酶（sucrosesynthase，Sus）和转化酶（invertase，INV）。根据INV 的亚细胞定位，可将转化酶分为细胞壁转化酶（cell wall invertase，CWIN）、液泡转化酶（ vacuolar invertase ， VIN） 和细胞质转化酶（cytoplasmic invertase，CIN）[17]。

蔗糖分解酶在植物块根/块茎的发育中发挥着不可或缺的重要作用。例如，利用反义RNA 技术分别下调胡萝卜中CWIN、VIN、Sus 基因的表达均会导致胡萝卜肉质根的生长发育受到显著抑制[18-19]。在马铃薯中下调Sus 基因表达则导致块茎数量减少，同时淀粉含量也下降[20-21]。因此，推测蔗糖代谢在甘薯产量和品质形成中也发挥着重要的调控作用，而PBZ 可能通过调控蔗糖分解酶的活性来影响甘薯块根的生长发育和产量形成。

本研究以海南鲜食甘薯主栽品种高系14 为实验材料，在定植早期（定植后20～30 d）对其进行PBZ 处理后测定块根产量、单薯鲜重、单株结薯数等指标，以明确PBZ 处理对甘薯产量的影响。其次，测定PBZ 处理对不同发育阶段（定植后30、60、90、120 d）块根中可溶性糖和淀粉含量、4种蔗糖分解酶活性的影响，同时测定PBZ 处理对蔗糖分解酶基因家族成员表达水平的影響。上述研究可初步阐明PBZ 调控甘薯块根发育的蔗糖代谢相关生理生化机制并确定其中的关键蔗糖分解酶基因，为甘薯高产、稳产甘薯新品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究于2022 年1—4 月在海南大学实验基地大棚内进行，试验材料选取海南甘薯主要栽培品种高系14。在大棚内采用盆栽种植的方式，根据甘薯每个采样阶段设置处理组与对照组，处理组在甘薯定植后20 d 和30 d，采用100 mg/L 的PBZ 进行叶面喷施处理，每个阶段每组设置4 个生物学重复。定植前将土壤与有机肥按3∶1 混匀，再按每盆0.8 g 的量加入史丹利复合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）混匀后，分装至每个直径约30 cm 的花盆。定植时打孔深度约15 cm，用75%的酒精消毒后的剪刀剪取约20 cm 长，顶端含有茎尖的甘薯茎段进行盆栽扦插，茎段切口为平切口。取样时期为定植后30、60、90、120 d，对甘薯块根进行取样。每个样品的取样重量为0.2 g，于液氮中速冻后置于–80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法

参照LUNN 等[22]的酶学方法测定甘薯块根中葡萄糖、果糖及蔗糖含量；参照SMITH 等[23]的酶学方法测定甘薯块根中的淀粉含量；采用分光光度计法，具体参照TOMLINSON 等[24]的方法测定甘薯块根中转化酶和蔗糖合成酶活性。

根据试剂盒的方法，使用总RNA 提取试剂盒[康为世纪OmniPlant RNA Kit（Dnase I）全能型植物RNA 提取试剂盒]从处理组与对照组4 个生长阶段的块根中提取总RNA，接着使用超微量分光光度计测定总RNA 的浓度与质量，并通过凝胶电泳检查总RNA 的完整性；然后采用高质量的总RNA 作为模板，使用诺唯赞HiScript III 1st StrandcDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒合成cDNA；最后使用前人已发表以及近期本课题组筛选和设计的20 个关键蔗糖分解酶基因和5 个SWEET 基因的特异引物用于qRT-PCR 测定（表1），使用諾唯赞ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒，在德国耶拿qTOWER3G 定量PCR 仪上进行基因表达水平的测定。qRT-PCR 反应程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。采用2–^ΔΔC_T法对qRTPCR的测定结果进行计算，以甘薯块根内ACTIN基因为内参基因。

1.3 数据处理

利用Excel 2020 软件作图，使用SPSS 26.0软件的t-test 功能进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 PBZ 对甘薯地上部生物量和块根产量的影响

叶面喷施PBZ 导致高系14 的地上部（茎叶）鲜重呈现出低于对照的趋势，特别是在定植后60 d时，PBZ 处理显著降低了高系14 的地上部鲜重（图1A）。在地下部薯块鲜重方面，PBZ 处理的单株薯块鲜重在定植后30、60 d 大于对照组，并在定植后60 d 单株薯块鲜重显著大于对照，但PBZ处理并没有提高定植后90、120 d 的薯块鲜重（图1B）。上述数据表明，定植早期的PBZ 处理（定植后20、30 d 喷施）会在短时间内（定植后60 d）抑制甘薯地上部生长，提高甘薯地下部薯块的产量，但随着时间的延长，PBZ 的效果逐渐消失。

为进一步分析PBZ 处理导致薯块产量增加的具体原因，对单薯鲜重和单株结薯数进行测定。结果表明，PBZ 处理显著提高定植后60 d 的单薯鲜重，但在其他3 个时期，PBZ 处理和对照之间均无显著差异（图1C）。此外，PBZ 处理对单株结薯数无显著影响（图1D）。上述数据表明，PBZ处理对甘薯块根的增产效果主要是通过增加单薯鲜重来实现。

2.2 PBZ 对甘薯块根中可溶性糖与淀粉含量的影响

为进一步研究PBZ 处理对甘薯品质的影响，对定植后30、60、90、120 d 甘薯块根中可溶性糖（葡萄糖、果糖、蔗糖）和淀粉含量的动态变化进行测定。结果表明，PBZ 处理可提高块根中的葡萄糖和果糖含量（图2A、图2B），特别是PBZ 处理组的葡萄糖含量在定植后60 d 显著高于对照组，在定植后90 d 极显著高于对照组；此外，PBZ 处理组的果糖含量在定植后60 d 极显著高于对照组。PBZ 处理块根中蔗糖含量在定植后30 d显著高于对照，而在其他3 个时期则均无显著差异（图2C）。

对淀粉含量的测定表明，块根中的淀粉含量在定植后30～60 d 均迅速增加，在发育后期（定植后90～120 d）淀粉含量呈现略微下降趋势（图2D）。与可溶性糖含量类似，PBZ 处理块根中淀粉含量在4 个时期均高于对照组块根，并且在定植后60 d 显著高于对照组。总体来看，PBZ 处理可在短时间内（定植后30～60 d）显著提高块根中的可溶性糖和淀粉含量，但随着时间的延长，PBZ处理的效应逐渐消失。

2.3 PBZ 对甘薯块根中蔗糖分解酶活性的影响

可溶性糖含量测定表明，与对照相比，PBZ处理提高了块根中的可溶性糖和淀粉含量，且在处理后的短时期内表现为显著增加，推测这可能是由于PBZ 处理对蔗糖分解酶活性的影响而导致的。对甘薯块根中蔗糖合成酶和3 种蔗糖转化酶活性的测定表明，块根中Sus 的活性要远高于3种转化酶中的任何一种，且PBZ 确实影响了蔗糖分解酶的活性（图3）。具体来看，PBZ 处理导致块根中的CWIN 活性上升，特别是在定植后60 d，PBZ 处理块根中的CWIN 活性显著高于对照组块根；而在其他3 个时期，处理组的CWIN 活性虽然高于对照组，但差异不显著（图3A）。PBZ 处理组的CIN 活性总体呈现出高于对照组的趋势，且在定植后60 d 显著高于对照组，在其余3 个时期无显著差异（图3B）。

此外，与CWIN 和CIN 不同，PBZ 处理组对VIN 活性的影响无明显规律，且PBZ 处理组和对照组的VIN 活性在4 个时期均无显著差异（图3C）。PBZ 处理组的Sus 活性在4 个时期均高于对照组（图3D），且在定植后30 d 极显著高于对照组；而在其余3 个时期，处理组和对照组之间均无显著差异。综上所述，PBZ 处理总体上呈现出提高块根中CWIN、CIN 和Sus 活性的作用，特别是在处理后的短时间内（定植后30～60 d）可显著提高CWIN、CIN 和Sus 的活性；但是，PBZ 处理在4 个时期内对VIN 活性均无显著影响。

在受到PBZ 诱导的3 种蔗糖分解酶中，Sus受到PBZ 诱导的时间（定植后30 d）要早于CWIN和CIN 活性受到诱导的时间（定植后60 d），而且Sus 活性受PBZ 诱导的幅度要远高于CWIN 和CIN 活性受诱导的幅度。此外，PBZ 处理组和对照组的3 种转化酶活性在4 个时期的动态变化趋势一致，即PBZ 处理并未对3 种转化酶活性随块根发育的动态变化规律产生影响。然而，PBZ 处理对Sus 活性随块根发育的动态变化规律产生了显著的影响，对照组的Sus 活性呈先上升后下降的趋势（图3D），而PBZ 处理组的Sus 活性始终呈现不断下降的趋势。上述Sus 与CWIN/CIN 之间的差异表明Sus 可能在PBZ 调控甘薯块根发育中发挥着更为重要的作用。

2.4 PBZ 处理对蔗糖分解酶基因家族成员表达的影响

上述蔗糖分解酶活性的测定表明，PBZ 处理可通过提高块根中蔗糖分解酶（CWIN、CIN 和Sus）的活性来增加块根中的可溶性糖和淀粉含量，因为高活性的蔗糖分解酶可增加块根的库强，加快蔗糖由光合叶片向块根的转运并合成淀粉进行储藏。近期张文杰[25]从甘薯基因组中共鉴定出12 个CIN 基因和9 个Sus 基因，其中7 个CIN基因（IbCIN3、IbCIN4 和IbCIN7～11）和5 个Sus基因（IbSus2、IbSus5～7 和IbSus9）在块根中高表达。此外，我们从甘薯基因组进一步鉴定出4个CWIN 基因（表1）。利用已发表的CIN 和Sus的引物以及自己设计CWIN 引物，我们研究了PBZ 处理对上述在块根中高表达的CIN、Sus 和CWIN 基因家族成员表达水平的影响，以明确PBZ 是通过调控哪些特定基因家族成员来实现对甘薯块根中糖分和淀粉含量的控制，从而最终影响到块根的膨大和发育。

测定结果表明，在4 个CWIN 基因中，只有3 个CWIN 基因（IbCWIN1、IbCWIN2 和IbCWIN4）在块根中有表达（图4A～图4C）。块根中这3 个CWIN 基因的表达量均是在块根发育早期（定植后30 d）最高，随着块根的发育（60～120 d）快速下降（图4A～图4C）。PBZ 处理显著提高IbCWIN1 在30 d 的表达量（图4A）。此外，PBZ 处理还显著提高IbCWIN2 在60 d 以及IbCWIN4 在60 d 和90 d 的表达量（图4B、图4C）。7 个在块根高表达的CIN 基因中，PBZ处理只对其中3 个CIN 基因（IbCIN3、IbCIN7和IbCIN8）表达量产生了显著影响（图4D～图4F），对其他4 个CIN 基因并无显著影响。具体来看，PBZ 显著提高了IbCIN3、IbCIN7 和IbCIN8在定植后60 d 的表达量（图4D～图4F）。此外，PBZ 还显著提高了IbCIN7 在90 d 的表达量（图4E）。

与 CWIN 和CIN 类似，在块根中高表达的5个Sus 基因的表达也均受到PBZ 处理的诱导。特别是在定植后30 d，IbSus2、IbSus5-7 和IbSus9的表达水平表现为PBZ 处理组显著高于对照组，其中IbSus5、IbSus7、IbSus9 表现为极显著差异（图5A～图5E）。此外，IbSus7 的表达在定植后90 d 也受到PBZ 的显著诱导（图5D）。

3 讨论

前人的研究表明，PBZ 处理效果存在着不确定性，其可通过提高单薯重和结薯数2 种指标中的任何一种或同时提高2 种指标来增加甘薯产量[13-15]。这种不确定性可能和PBZ 处理的时间有关，目前已有的研究大多数PBZ 处理时间发生在植株封垄以后，大约在定植后50 d 左右[13-15]。此时，甘薯根60 d），且Sus 活性受PBZ 诱导的幅度要远高于CWIN 和CIN 活性受诱导的幅度。Sus 与CWIN/IN在这2 个方面的差异表明Sus 可能在PBZ 调控甘薯块根发育中发挥着更为重要的作用。研究表明，INV 和Sus 分别在植物器官发育的不同时期发挥着不同的功能。通常INV 活性在器官发育早期较高，主要和细胞分裂和器官的形成相关，而Sus活性在器官发育后期较高，主要和淀粉、纤维素的合成以及细胞和器官的膨大相关[28-31]。因此，INV 对植物生长发育的影响要大于Sus，前者可以影响库器官的数量，而后者则主要影响库器官的大小。例如，VIN 在棉花上的突变导致产生完全无纤维的棉花种子[30]，而Sus 突变则主要抑制棉花种子上纤维的伸长生长而对纤维数量影响不大[31]。

在胡萝卜上，VIN 和CWIN 的突变导致肉质根的膨大完全受到抑制，而Sus 的突变只是导致肉质根变小，并不影响其数量[18-19]。本研究结果表明，PBZ 处理改变了Sus 活性随块根发育的动态变化规律，且PBZ 处理导致块根Sus 活性在定植后30 d 极显著上升，增加幅度高达500%，这极大地促进块根中淀粉的积累和块根的膨大。虽然PBZ在定植后60 d 的CWIN 和CIN 活性也显著上升，但上升幅度相对较小，最终表现为Sus 活性远高于CWIN 和CIN 活性的总和。因此，推测较早受到PBZ 诱导且活性较高的Sus 可能会导致块根中的蔗糖主要被Sus 分解，从而用于淀粉的合成和块根的膨大，这会导致经过CWIN 和CIN 分解的蔗糖的量不足，最终抑制新块根的形成。

虽然CWIN 和CIN 没有对结薯数产生影响，但其可能对甘薯的品质产生一定的影响。和INV分解蔗糖产生葡萄糖和果糖不同，Sus 分解蔗糖产生的是UDP-葡萄糖和果糖，但不产生游离的葡萄糖。因此，PBZ 处理下块根中游离葡萄糖含量的升高很可能是由于CWIN 和CIN 活性上升导致。此外，CWIN 和CIN 产生的葡萄糖和果糖还可以通过呼吸途径为淀粉的合成和块根的生长提供能量供应。因此，PBZ 处理下，Sus、CWIN 和CIN 三者共同作用的最终结果为PBZ 处理显著增加了单薯鲜重和块根中的可溶性糖和淀粉含量，但对单株薯块数量无显著影响。

甘薯基因组中共有9 个Sus 基因，其中5 个Sus 基因（IbSus2、IbSus5-7 和IbSus9）在块根中高表达[25]。这5 个Sus 基因的表达量在定植后30 d均受到PBZ 处理的诱导，其中IbSus5、IbSus7、IbSus9 表现为极显著差异，而IbSus2 和IbSus6 受到显著诱导。这可以很好地解释定植后30 d 甘薯块根中Sus 活性受到PBZ 诱导的现象。

此外，甘薯基因组中共鉴定出12 个CIN 基因，其中7 个CIN 基因（IbCIN3、IbCIN4 和IbCIN7-11）在块根中高表达[25]。这7 个CIN 基因中，PBZ 处理只对其中3 个CIN 基因（IbCIN3、IbCIN7 和IbCIN8）表达产生诱导作用，且诱导主要发生在定植后60 d，这和CIN 活性的诱导主要发生在60 d 相一致。从甘薯基因组中共鉴定出4个CWIN 基因中，其中只有3 个CWIN 基因（IbCWIN1、IbCWIN2 和IbCWIN4）在块根中有表达。和CWIN 活性在定植后60 d 受到PBZ 诱导相对应，IbCWIN2 和IbCWIN4 表达量在定植后60 d 受到显著诱导。和甘薯产量指标以及淀粉和可溶性糖含量指标类似，PBZ 对蔗糖分解酶活性及其基因表达水平的影响也主要发生在PBZ 处理后的短时期内（定植后30～60 d），而在定植后期（90～120 d）PBZ 的处理效果消失。

综上所述，PBZ 处理下Sus 表达和活性增加的时间更早、幅度更大，这可以促进淀粉的快速积累和块根的快速膨大。而随后CWIN、CIN 表达和活性的上升则可为淀粉的合成和块根的膨大提供能量供应，同时增加块根中的可溶性糖含量，改善甘薯品质。本研究还鉴定出上述3 种蔗糖分解酶基因家族中受到PBZ 诱导表达的特定成员。PBZ 对甘薯塊根产量、品质、蔗糖分解酶活性及其基因表达水平的影响主要发生在PBZ 处理后的短时期内（即定植早期）；随着PBZ 处理时间的延长也就是在定植后期PBZ 对上述指标的影响逐渐消失。因此，生产上为了提高甘薯产量，有必要在全生育期进行PBZ 处理。上述研究结果可为下一步通过品种选育和栽培等措施实现甘薯优质、高产提供理论依据。