低温胁迫下不同甘蔗品种的生理响应及耐寒性评价

饶席兵　钱禛锋　曾丹　张蓉琼　吕绍芝　沈庆庆　吴华英　何丽莲　李富生

关键词：甘蔗；耐寒性；生理響应；主成分分析；聚类分析；综合评价

中图分类号：S566.1 文献标志码：A

甘蔗（Saccharum officinarum L.）原产于热带亚热带地区，种植面积近2700 万hm2，分布在全球120 多个国家，贡献了全球糖总产量的80%以上[1]。除了传统的糖生产，甘蔗因其巨大的生物产量和大规模的糖蜜乙醇生产而被公认为重要的能源和生物燃料作物，它还是生产生物丁醇和柴油最有效的原料， 占世界生物燃料总产量的40%[2]。此外，在甘蔗生产过程中还能获得其他有价值的副产品，包括纸、醋酸、胶合板和工业酶等[3]。甘蔗是一种喜温作物，然而云南的气候存在“两头低温”的特点；在早春时节，西北地区吹来的冷空气与南方暖湿空气相持形成持续性低温阴雨天气——“倒春寒”，而这时甘蔗正处于幼苗期，严重阻碍了甘蔗幼苗的生长发育。并且，在甘蔗生长后期又容易面临霜冻的侵袭，进而影响甘蔗糖分的积累。因此，培育出抗逆性强的甘蔗品种成为现阶段甘蔗育种的主要方向之一。

植物受到低温胁迫后一方面可以根据植株的外部表型受害情况，另一方面能通过生理生化数据的改变所呈现，故均可用于植物的耐寒性评价。李杨瑞等[4]研究了寒害对甘蔗外部形态的影响，发现低温使得甘蔗蔗叶、蔗茎都有不同程度的损伤。周会等[5]发现甘蔗节间生长点比节间组织更容易受到低温伤害。据报道，丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、脯氨酸（Pro）含量以及抗氧化酶活性与植物的耐寒能力密切相关。包昌艳等[6]研究表明，强耐寒性西藏箭竹和错那箭竹能保持较高水平的SP、Pro 含量和较低水平的MDA 含量。丘立杭[7]研究表明，低温胁迫后强耐寒性的甘蔗品种SS 含量最高且增幅最大。陆思思等[8]发现低温处理后，强耐寒性甘蔗品种的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性均高于不耐寒品种。植物耐寒分子机制研究表明，植物体内碳水化合物代谢及其相关基因的表达与植物的耐寒能力有关[9]。牛俊奇等[10]发现蔗糖代谢相关酶基因的表达可以平衡蔗糖代谢过程，从而使植物更好适应低温环境。CHEN 等[11]发现耐寒相关响应基因DREB、COR413、CSD 参与菊花的低温应答反应。

研究表明，甘蔗耐寒性属中偏低遗传力性状[12]，杂交后代的耐寒性与其亲本的耐寒能力密切相关[13-14]。因此，合理评价甘蔗耐寒种质资源，对种质创新和改良甘蔗耐寒性有重大意义。主成分分析能够确定合理概括整体的主要因子，被研究人员广泛用于植物的抗旱、耐寒性评价[15]。隶属函数法弥补单一指标带来的偏差，使评定的结果与实际结果较为接近，是近年来植物抗逆性评价方法中最常用的方法，已在含笑[16]、野生苔草[17]、苹果[18]、水稻[19]等作物耐寒性评价中应用，聚类分析可以对不同的材料直观地分类[20-21]。本研究以8 份不同品种甘蔗及1 份甘蔗近缘野生种蔗茅无性系为试验材料，研究其低温胁迫下的生理响应特点，并通过主成分分析、模糊隶属函数法以及聚类分析进行耐寒性综合评价，为研究甘蔗低温胁迫应答调控机理，选育强耐寒性甘蔗新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究涉及的甘蔗材料包括新台糖22 号（ROC22）、新台糖20 号（ROC20）、新台糖10号（ROC10）、新台糖16 号（ROC16）、滇蔗01-58、崖城89-9、黄加利、粤糖93-159，为进一步清晰地评价各甘蔗品种的耐寒特性，故加入一个具有较强耐寒能力的甘蔗近缘野生种（蔗茅99-1）。所有供试材料均由云南农业大学甘蔗研究所资源圃种植保存。

首先将供试材料盆栽于温室大棚内，待生长至3～4 叶期，将处理组（3 ℃，3 d）置于光量子通量密度为300 μmol/（m²s），光周期为13 h/d，相对湿度为60%～70%的低温光照培养箱中进行胁迫处理；对照组（30 ℃，3 d）置于温室大棚中正常生长。到达胁迫处理时间点后分别将样品（+1叶）取回，用液氮保存，进行耐寒相关生理指标测定。

1.2 方法

1.2.1 指标测定 利用格锐思生物公司的试剂盒，采用硫代巴比妥酸法进行MDA 含量测定，采用可见分光光度法进行Chl 含量测定，采用蒽酮比色法进行SS 含量测定， 采用BCA 法进行SP 含量测定，采用酸性茚三酮法进行Pro 含量测定，采用WST-8 法进行SOD 活性测定，采用愈创木酚法进行POD 活性测定，采用显色法法进行CAT 指标测定。

1.2.2 耐寒性综合评价 通过主成分分析法转化待评价指标，用模糊数学隶属函数法计算对应的隶属函数值，最后以D 值综合评价各材料的耐寒性。

1.3 数据处理

分别使用Excel 2009、DPS（7.05）软件进行绘图和数据差异显著性分析，使用SPSS 26 软件进行主成分分析及聚类分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对甘蔗叶片生理指标的影响

2.1.1 低温胁迫对甘蔗叶片MDA、Chl 含量的影响 低温胁迫处理3 d 后，除了崖城89-9 以外，其余供试材料的MDA含量均升高。其中，ROC16、ROC22 和滇蔗01-58 的MDA 含量较CK 差异达极显著（图1A）；以滇蔗01-58 的相对值最大，为190%，崖城89-9 的相对值最小，为87%（表1）。Chl 含量方面，低温胁迫3 d 后，ROC22、滇蔗01-58 及粤糖93-159 三份材料的Chl 含量降低，其余6 份材料的Chl 含量均升高；其中，ROC20、ROC10、崖城89-9、黄加利及蔗茅99-1 较CK差异显著（图1B）；以蔗茅99-1 的相对值最大，为172%，粤糖93-159 的相对值最小，为64%（表1）。

2.1.2 低溫胁迫对甘蔗叶片SS、SP、Pro 含量的影响 结果表明，低温处理3 d 后，不同材料间SS 含量变化存在差异，ROC20、滇蔗01-58、黄加利、粤糖93-159 的SS 含量较CK 极显著降低，其余5 份材料的SS 含量较CK 极显著升高（图1C）；其中，崖城89-9 的相对值最大，为227%；黄加利的相对值最小，为33%（表1）。SP 含量方面，ROC20、滇蔗01-58、粤糖93-159 处理前后变化不明显；ROC22、黄加利低温胁迫后降低，ROC16、崖城89-9、蔗茅99-1 较CK 极显著升高（图1D）；以蔗茅99-1 的相对值最大，为164%；ROC22 的相对值最小，为58%（表1）。所有材料的Pro 含量经低温胁迫后均升高，其中，ROC22、ROC10、崖城89-9，粤糖93-159 及蔗茅99-1 较CK 差异极显著（图2A）；以蔗茅99-1 的相对值最大，为172%（表1）。

2.1.3 低温胁迫对甘蔗叶片SOD、POD、CAT 活性的影响 低温胁迫3 d 后，所有材料的SOD 活性均下降。其中，ROC20、ROC22、崖城89-9 的SOD 活性较CK 显著降低，ROC10、黄加利、粤糖93-159 和蔗茅99-1 较CK 极显著降低（图2B）；以ROC20 相对值最大，为92%，崖城89-9 的相对值最小，为58%（表1）。ROC22、黄加利和滇蔗01-58 的POD 活性经低温处理后变化不明显，其他材料的POD 活性均显著高于CK（图2C）；相对值最大的是崖城89-9，为162%。CAT 活性方面，低温胁迫前后崖城89-9 变化不大，ROC22极显著低于CK，其他材料均极显著高于CK（图2D）；相对值最高的是滇蔗01-58，达到331%，最低的是ROC22，仅有67%。

2.2 各生理指标之间的相关性分析

相关性分析结果显示，SOD 与Pro 呈显著负相关、与MDA 呈显著正相关；POD 与SS、SP 呈显著正相关，与MDA 呈极显著负相关。SS 与SP 呈显著正相关；其中，POD 与可溶性蛋白的相关系数最大，R²=0.799，其他指标间相关性不显著（表2）。

2.3 主成分分析

将8 个耐寒性指标的相对值进行主成分分析，由表3 可知，共得到3 个主因子，其中，主因子1 的特征值为3.940，具有49.247%的贡献率；主因子2 的特征值为1.613，具有20.164%的贡献率；主因子3 的特征值为1.005，具有12.559%的贡献率。3 个主因子的特征值均大于1，累计贡献率为81.970%（表2）。将8 个耐寒生理指标转化为3 个独立的综合指标，对甘蔗耐寒性指标进行评价。主因子1 中，系数较大的有POD（0.940）、MDA（-0.882）、SP（0.784）、SOD（-0.709），绝对值均大于0.700。主因子2 中，系数最大的是叶绿素（0.662），最小的是POD（0.143）。主因子3 中，系数最大的是CAT（0.698），最小的是POD（0.391）（表2）。

2.4 耐寒性综合评价

结合生理指标的相对值和主因子系数得到主因子得分PC 值，由表4 可知，崖城89-9 在主因子1 中的数值最大，粤糖93-159 在主因子2 中的数值最大，黄加利在主因子3 中的数值最大。通过模糊隶属函数法计算出各主因子的隶属函数值。在主因子1、主因子2、主因子3 中，隶属函数值中的最大（1.00）的分别是蔗茅99-1、崖城89-9、滇蔗01-58，表明各自在不同主因子中耐寒性最强，隶属函数值最小（0.00）的分别是滇蔗01-58、粤糖93-159、黄加利，表明各自在不同主因子中耐寒性最弱。根据主成分分析得到的主因子贡献率计算出3 份主因子的权重。主因子1 的权重为0.60，主因子2 的权重为0.25，主因子3的权重为0.15。再根据隶属函数值和权重计算得到综合评价值（D），D 值越大则耐寒性越强。其中，D 值较大的是蔗茅99-1（0.84）、崖城89-9（0.83）、ROC10（0.74），D 值较小的是ROC22（0.23）、滇蔗01-58（0.24）、黄加利（0.41）；9份材料的耐寒性排序为： 蔗茅99-1> 崖城89-9>ROC10> ROC16>粤糖93-159>ROC20>黄加利>滇蔗01-58>ROC22。

2.5 聚类分析

将综合评价值（D）利用组间联接法和平方欧氏距离进行聚类分析，在欧氏距离5 处将9 份材料分为3 个类群，对应耐寒性为强、中、弱3个等级。第Ⅰ类群包括蔗茅99-1、崖城89-9、ROC10，耐寒性强；第Ⅱ类群包括ROC20、粤糖93-159、黄加利、ROC16，耐寒性中；第Ⅲ类群包括滇蔗01-58、ROC22，耐寒性弱（图3）。

3 讨论

低温是影响甘蔗生长发育、产量以及分布的主要环境因子之一。探究甘蔗在低温逆境下的生理反应特性，筛选强耐寒性甘蔗亲本材料，对指导甘蔗育种及推动甘蔗产业发展有重要的意义。研究表明，叶片在植物光合作用、生理生化反应过程中发挥重要的作用，对外界温度的变化也较为敏感，可以作为植物耐寒性生理响应研究的重要器官[22]。故本研究以9 份低温胁迫的甘蔗叶片进行耐寒生理响应分析，从而综合评价其耐寒性。

当植物暴露于低温逆境时，体内会产生大量的ROS，随着胁迫程度的不断加深，打破了自由基产生与清除的动态平衡，导致细胞膜脂发生过氧化作用，膜内物质外渗并产生大量MDA，从而影响一系列生理生化反应的正常进行，故可通过MDA 含量的变化，分析膜系统受损程度以及植物的耐寒能力。黄丽芳等[23]研究表明，经低温胁迫后不同咖啡品种的MDA 含量呈上升趋势。彭云玲等[24]发现，玉米经低温胁迫后其MDA 含量均较CK 升高。本研究结果与前人的研究结果基本一致；经低温胁迫后，耐寒性相对较弱的ROC22、滇蔗01-58 中积累了较多的MDA，而在耐寒性相对较强的蔗茅99-1、崖城89-9 以及ROC10 中，MDA 的累积量并不多，说明MDA 含量是衡量植物低温耐受性的重要因素，可作为植物耐寒性评价的关键指标之一。低温胁迫下，叶绿体的超微结构被破坏，Chl 合成酶的活性显著降低，导致Chl 含量下降，进一步影响植物的光合作用与代谢。张保青等[25]、王振波等[26]研究发现，耐寒性较强的材料经低温胁迫后，其体内的Chl 含量仍能保持一个较高的水平；本研究结果与之一致。

经过漫长的选择与进化，植物形成了其特有的调控机制来适应逆境带来的不利影响，渗透调节便是其中的一种。SS、SP 和Pro 是重要的渗透调节物质，其积累能增加细胞内束缚水与自由水的比值、原生质的保水能力和细胞液浓度等，从而平衡在低温条件下的细胞代谢，对生物膜系统起到很好的保护作用，以抵御环境胁迫带来的不利影响[27]。何子华等[28]进行不同禾本科牧草的耐寒性评价，发现经低温胁迫后不同禾本科牧草的SS 含量和Pro 含量均呈不同程度的增加趋势。陈明辉等[29]发现6 个不同品种果蔗的SS、SP 和Pro含量随着低温胁迫时间的延长而持续升高。本研究中，经低温胁迫后，强耐寒性材料蔗茅99-1、崖城89-9 的SS、SP 以及Pro 含量较CK 极显著升高，说明渗透调节物质含量的增加，是植物对低温胁迫的一种应对策略；而在弱耐寒性材料中，SS 及SP 的含量反而低于CK，可能是由于超出其低温耐受范围，导致细胞内渗透失衡。

SOD、POD、CAT、APX、GR 等是植物体内重要的抗氧化酶，在植物逆境应答，活性氧清除过程中发挥着重要的作用。SOD 是植物抗氧化酶系统的第一道防线，它能特异性地将超氧阴离子（O₂^?）歧化为对植物毒害较小的H₂O₂；POD 可以催化由過氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应：RH₂+H₂O₂→2H₂O+R， 清除由逆境产生的H₂O₂；CAT 在清除植物体内的氧自由基时也起着重要作用[30]。全怡吉等[31]研究了不同甘蔗品种对低温的生理响应，发现低温胁迫后，蔗茎CAT 活性上升，而SOD、POD 活性下降。曹哲群等[32]研究结果表明，经低温（3 ℃）处理3 d 后，各甘蔗材料叶片的SOD 活性均有不同程度的下降。孙波等[33]发现低温持续胁迫下，甘蔗根系的POD、SOD 活性呈现先升高后降低的趋势，但耐寒性强的品种在处理后期也能保持一定的活性。本研究中，经低温胁迫后，所有材料叶片的SOD 活性均较CK 降低，多数材料的POD、CAT 活性较CK升高。该结果与前人研究结果有差异，可能是由于甘蔗基因型、测定时期、测定部位等不同所导致。在各指标相关性分析中，发现POD 与SS、SP 呈显著正相关，进一步说明POD 在植物甘蔗抵御低温胁迫中发挥着重要的作用。

研究表明，植物耐寒性属于多因素调控的数量性状，用单一指标、单一的分析方法作为植物耐寒性评价较为片面，采用多种指标增大数据处理量的同时，各指标信息也存在交叉与重叠现象。主成分分析法可将多个单项指标转化为互相独立的综合指标，不仅可以降低变量个数，同时又能保证不会对最终评价造成偏差。本研究利用主成分分析，共提取出3 个主因子，累计贡献率为81.970%；相关研究表明，主子因累计贡献率达80%以上得到的结果相对可靠。杨小英等[34]通过聚类分析，将不同品种玉米分为高度抗旱、中度抗旱、抗旱、敏感、高度敏感5 个亚群。金明等[35]将不同水稻种质材料分为耐寒性极强、耐寒性强、耐寒性中等、耐寒性弱和耐寒性极弱5 个等级。本研究通过聚类分析，将9 份甘蔗材料划分为强耐寒类型、中度耐寒类型和弱耐寒类型。

本研究通过分析不同甘蔗品种苗期叶片的生理响应，利用主成分分析、隶属函数等方法对其耐寒性进行综合评价。结果表明，耐寒能力最强的甘蔗品种为崖城89-9，最弱的为ROC22，强耐寒性甘蔗品种能够更好地提高渗透调节物质含量及抗氧化酶活性，进一步清除ROS，平衡细胞代谢过程，从而更好地适应低温环境。