胶体金免疫层析法在韭菜农药残留检测中的应用研究

2024-06-06张继梅冯文霞白新明李亚莉

甘肃农业科技 2024年5期

张继梅冯文霞白新明李亚莉

摘要：为验证胶体金免疫层析技术在韭菜农残检测中的可靠性和适用性，选用3种不同的农残胶体金免疫层析快速检测产品（胶体金农残快检试剂）检测韭菜中腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、克百威、三唑磷等6种农药残留，并将其与色谱质谱串联法进行比较，对其灵敏度、假阳性率及假阴性率进行验证评价。结果表明，在0.5 LOD的农药添加水平下，3种胶体金农残快检试剂对实验室空白样品的检测结果均为阴性；但当添加水平达到LOD或MLR时，其检测结果均为阳性，证明胶体金农残快检试剂灵敏度较高，且符合国家标准食品中农药最大残留限量要求；实验室加标试验和实际样品比对试验结果显示，胶体金农残快检技术与色谱质谱联用法的检测结果均无显著性差异（χ2 < 3. 84），其假阴性率和假阳性率均为0。故胶体金免疫层析法可在韭菜的农残快速检测中应用。

关键词：韭菜；农药残留；胶体金免疫层析法；快速检测；色谱质谱联用法

中圖分类号：TS255.9；S633.3 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2024）05-0476-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.05.016

Study on the Application of Colloidal Gold Immunochromatography

in the Detection of Pesticide Residues in Chinese Chives

ZHANG Jimei 1， FENG Wenxia 1， BAI Xinming 1， LI Yali 2

（1. Pingliang Agricultural Products Quality Safety Inspection and Testing Centre， Pingliang Gansu 744000， China;

2.Vegetable Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： To validate the reliability and applicability of colloidal gold immunochromatographic technology in the detection of pesticide residues in Chinese chives， 3 different types of colloidal gold immunochromatographic rapid test products（colloidal gold pesticide rapid test reagents） were used to detect 6 types of pesticide residues， including fludioxonil， imidacloprid， thiamethoxam， carbendazim， cypermethrin， and triazophos， in Chinese chives. These results were compared with those obtained using chromatography-mass spectrometry tandem method， assessing their sensitivity， false positive rate， and false negative rate. The results showed that at 0.5 LOD pesticide addition level， all 3 colloidal gold pesticide rapid test reagents yielded negative results for laboratory controls. However， when the addition levels reached LOD or MLR， the results were positive， demonstrating high sensitivity of the colloidal gold pesticide rapid test reagents， which comply with the national standards for maximum residue limits in food. Laboratory spike tests and actual sample comparison tests showed no significant differences（ χ2 < 3.84） between the colloidal gold rapid detection technology and the chromatography-mass spectrometry method， with both false negative and false positive rates being 0. Therefore， colloidal gold immunochromatographic method can be applied in the rapid detection of pesticide residues in Chinese chives.

Key words： Chinese chive; Pesticide residue; Colloidal gold immunochromatography; Rapid test; Chromatography-mass spectrometry tandem method

韭菜是一种多年生的鳞茎类蔬菜，因其气味辛香和口感鲜美而受到众多家庭的欢迎。但其生长期间极易感染病虫害，导致农残超标问题频发。农业农村部等 7 部门联合开展的食用农产品“治违禁控药残促提升” 三年行动中韭菜作为“三棵菜”（豇豆、韭菜及芹菜）之一进行重点整治［1 ］。多个地区对市售或产地韭菜中农药残留的监测表明，超标农药包括腐霉利、氯氟氰菊酯/高效氯氟氰菊酯、毒死蜱、百菌清、甲拌磷及多菌灵7种，而市场监督监测发现的韭菜中超标农药则有腐霉利、克百威、甲拌磷、啶虫脒、毒死蜱、三唑磷和吡虫啉等 14 种［2 - 6 ］。农业农村部农产品质量安全监管司《关于国家农产品质量安全监督抽查实施细则（2023年）的通知》中，将韭菜作为种植业产品监督抽查重点品种，将腐霉利、克百威及啶虫脒等18种禁用农药作为必检项目。

目前，在韭菜农药残留快速检测中最常用的方法是酶抑制率法，由于受到酶特异性的影响，此方法常用于检测有机磷和氨基甲酸酯两类农药［7 - 8 ］，但该方法易受酶试剂和酶活力的影响，检测结果可信度较低［9 - 10 ］。胶体金免疫层析农残快检法是以胶体金为示踪标志物，采用特异性抗原抗体反应及侧向层析的一种新型免疫标记分析技术［11 - 13 ］，可以直观地通过目测胶体金标志物的显色来测得结果［14 - 16 ］。其操作快速简便、适用广泛、成本低、特异性强及灵敏度高，较适合基层农产品监测监管机构在果蔬采摘上市前进行自检。

本研究采用3个不同厂家的胶体金农残快检试剂检测了韭菜中腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、克百威及三唑磷等6种农药的残留量，同时与色谱质谱联用定量法进行比对，并对其灵敏度、假阴性率、假阳性率及检测结果进行验证评价，进而为胶体金农残快检技术在韭菜质量安全监管和生产者安全自检工作中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试试剂

指示韭菜品种为汉中冬韭（市售）。供试腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、克百威及三唑磷等6种农药胶体金快检试剂盒分别由北京勤邦科技股份有限公司、广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司、厦门海荭兴仪器股份有限公司提供。腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、克百威、三唑磷等6种农药的标准品由农业农村部环境保护科研监测所（天津）提供。

1.2 仪器与设备

PL602E型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）、IKA■Vibrax VXR basic漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、HR/T20MM高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、N-EVAP-24型氮吹仪（北京康林科技有限责任公司）、Agilent 7000C气质联用仪及Agilent 6460液质联用仪（安捷伦科技中国有限公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 胶体金免疫层析法 ①原理：本方法采用胶体金免疫层析原理。样品中的农药（即目标物）经提取后，在温育过程中与胶体金标记的单克隆抗体相结合，抑制了检测微孔中的金标抗体和试纸中检测线（T线）上的抗原結合，从而产生检测线颜色深浅的变化，通过对检测线与对照线（C 线）颜色深浅进行比较，即可对样品中农药进行快速的定性判断［17 - 20 ］。 ②方法：取新鲜韭菜擦去泥土，剪成小于1 cm 见方的碎片作为待测样品。称取一定量的待测样品于15 mL 或50 mL离心管中，加入提取液，盖上盖子，涡旋仪涡动或手动上下振荡混匀，即得样品待测液。吸取样品待测液垂直缓慢滴入微孔中，反应8～10 min后判定结果。③ 结果判定：若T线显色高于或者等于C线显色，则检测结果为阴性，表示样品中残留的农药浓度低于检测限；若T线显色低于C线显色或者T线不显色，则检测结果为阳性，表示样品中残留的农药浓度等于或高于检测限；若未出现C线，则表示操作过程不正确或试纸条已失效。

1.3.2 定量检测法按照《植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱联用法》（GB 23200.121—2021）和《植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱-质谱联用法》（GB 23200.113—2018）规定的方法进行定量检测。

1.4 结果评价

按照国家食药总局公布的《食品快速检测方法评价技术规范》，对胶体金农残免疫层析快速检测试剂的灵敏度、假阳性率以及假阴性率进行评价［21 ］。

2 结果与分析

2.1 灵敏度试验

《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB2763—2021）对韭菜中腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、克百威及三唑磷6种农药最大残留量（MRL）均有规定，不同厂家胶体金农残快检试剂对不同农药的检出限（LOD）在产品说明书中均有说明（表1）。本试验根据胶体金农残快检试剂的LOD和农药的MRL设置4个加标水平，即0 LOD（对照）、0.5 LOD、1.0 LOD、2.0 LOD或MRL（若LOD = MRL，则设定为2.0 LOD；若LOD ＜ MRL，则设定为MRL），每份试验样品均做7个平行试验，结果见表2。3种供试胶体金农残快检试剂中，验证的6种农药参数产品检出限均可以达到胶体金试剂盒说明书描述的最低水平，且符合其国家最大残留限量标准要求，6种农药参数的产品灵敏度均符合要求。

2.2 加标假阳性率试验

选取添加水平为0 LOD、0.5 LOD的样品进行假阳性率检测验证，同时采用色谱质谱联用法确认为阴性，用胶体金农残快检试剂对其假阳性率进行验证。液相色谱－质谱串联法中啶虫脒、吡虫啉、克百威、多菌灵的最低检出限分别是0.33、5.30 、0.46 、0.21 μg/kg；气相色谱－质谱串联法中腐霉利、三唑磷的最低检出限分别是7.20 、0.87 μg/kg。从表3可以看出，3种供试胶体金农残快检试剂在0 LOD、0.5 LOD添加水平的样品中，验证的6种农药参数的假阳性率均为0%。

2.3 加标假阴性率试验

选取MRL添加水平的样品进行假阴性率检测验证，同时采用色谱质谱联用法确认为阳性，再用胶体金农残快检试剂对其假阴性率进行验证。结果表明，3种胶体金农残快检试剂在MRL添加水平的样品中，验证的6种农药参数的假阴性率均为0 （表4）。

2.4 实际样品比对试验

随机从当地市场上抽取韭菜样品10份，每份样品做7个平行试验。先用色谱质谱串联定量法检测出样品中农药含量，再用胶体金农残快检试剂进行定性检测，以验证其灵敏度、假阳性率或假阴性率，结果见表5。可以看出，当农药残留量高于胶体金农残快检试剂检出限时，用胶体金农残快检试剂检测结果均为阳性。实际样品验证的6种农药参数的假阳性率和假阴性率均为 0，与色谱质谱联用法间均无显著差异（χ2< 3. 84）。

3 讨论与结论

目前在农产品质量安全监管工作中最常用的农残检测方法有仪器定量法和快速定性法［8 ］。仪器定量法主要适用于在专业实验室开展农残检测工作，其检测成本较高、耗时长，对检测人员专业技术水平要求较高；速测定性法应用最为广泛的是酶抑制率法，主要针对果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，该方法稳定性和重复性较差，且不能满足国家最大残留限量要求［16 ］。与仪器定量法和酶抑制率速测法相比，胶体金农残速测法可在15 min内可完成从样品前处理到测得结果的检测工作，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点，可作为蔬菜中农药残留快速检测方法对蔬菜中的农药残留在基层从源头上进行科学控制［22 ］。但由于不同种类蔬菜中的农药残留限量值不同，在实际应用过程中，若产品的检出限高于农药最大残留限量值，则会造成部分阳性样品出现漏检的问题［7 ］，并且在一些特殊样品（如茶鲜叶）的检测中容易出现假阴性［20 ］。本研究中所采用的不同胶体金农残试剂卡仅限于检测韭菜中某种特定农药残留，在检测韭菜中多种农药残留时存在检测成本高、任务大、时间長等问题。为了节约检测成本，提高检测效率，需要研发检测多种农药残留的多组分胶体金农残速测产品，同时还应排除不同农药间的交叉反应［11， 22 - 23 ］。

本研究采用不同厂家的胶体金农残快检试剂检测韭菜中腐霉利、吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、克百威及三唑磷6种农药的残留，并用色谱质谱联用法对其灵敏度、假阴性率、假阳性率及检测结果进行验证评价。研究结果表明，实验室空白样品在0.5 LOD的农药添加水平下，北京勤邦科技股份有限公司、广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司、厦门海荭兴仪器股份有限公司等3个生产厂家的胶体金农残快检试剂的检测结果均为阴性；但当添加水平达到LOD或MLR时，其检测结果均为阳性，证明胶体金农残快检试剂灵敏度较高，符合国家标准食品中农药最大残留限量要求。胶体金农残速测法和色谱质谱联用法对随机抽取的实际样品进行比对试验，2种方法的检测结果一致，假阳性率和假阴性率均为0，且无显著性差异（χ2 < 3. 84），这与占绣萍等［14 ］、陈美莲等［9 ］的研究结果一致。总之，用胶体金农残快检试剂检测韭菜中农药残留是可靠的，农产品监测监管机构可用该方法在韭菜采摘上市前进行自检，从而达到控制韭菜中农药残留超标的目的。

参考文献：

［1］关于印发《食用农产品“治违禁控药残促提升”三年行动方案》的通知［J］. 中华人民共和国农业农村部公报，2021（7）：6-9.

［2］马新耀，刘娇，李伟，等. 基于食品安全指数法和危害物风险系数法评估山西省韭菜中农药残留的风险［J］. 中国蔬菜，2022，42（7）：92-97.

［3］温雅君，肖志勇，马啸，等. 韭菜中农药残留状况调查与分析［J］. 食品安全质量检测学报，2020，11（13）：4231-4235.

［4］刘霞丽，姚晓洁，宁亚萍，等. 河南省韭菜中农药残留情况分析及膳食暴露评估［J］. 中国食品卫生杂志，2023，35（2）：230-236.

［5］刘淑梅，秦淑国，武可，等. 宿州市市售韭菜和芹菜中农药残留及暴露风险［J］. 食品安全导刊，2020，

14（24）：129-131+134.

［6］曾静，乔雄梧. 我国近年蔬菜水果中农药残留超标状况浅析［J］. 农药学学报，2023，25（6）：1206-1221.

［7］章慧，丰东升，张唯谊，等. 胶体金法快速检测蔬菜中哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺残留的应用研究［J］. 上海农业学报，2021，37（2）：121-126.

［8］陆萍，顾心悦，仇婷婷，等. 胶体金农残快速检测技术应用初探［J］. 上海农业科技，2023，53（1）：25-26.

［9］陈美莲，章慧，丰东升，等. 胶体金法快速检测蔬菜中多菌灵·吡虫啉和啶虫脒的应用研究［J］. 安徽农业科学，2020，48（22）：193-197.

［10］徐为霞，郭智广，王毅红. 农药残留速测试剂盒在实际应用中的问题分析［J］. 中国卫生检验杂志，2019，