基于网络药理学预测姜黄素联合小檗碱改善药物性肝损伤的潜在作用机制

王佳乐 刘跃 毛煦

[摘要] 目的 將体内实验与网络药理学相结合，初步探讨姜黄素（curcumin，CUR）联合小檗碱（berberine，BBR）改善药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）的潜在作用机制。方法 建立对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）诱导DILI动物模型，检测小鼠血清丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）与天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。应用网络药理学方法搜集CUR、BBR、DILI相关靶点，通过韦恩映射筛选交集靶点，构建CUR-BBR-DILI蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interactions，PPI）网络，进而进行基因本体（gene ontology，GO）功能与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。结果 体内实验结果显示CUR联合BBR可显著减少小鼠血清ALT与AST水平，优于单独给药；网络药理学实验结果显示PharmMapper数据库共搜集到CUR相关靶点291个、BBR相关靶点208个；Genecards数据库共搜集到DILI相关靶点904个；Venny 2.1.0数据库共筛选出77个交集靶点；GO与KEGG分析分别得到52条基因功能和20条信号通路，可能与两药合用改善DILI有关；PPI网络中度值排名前10的核心靶点有9个富集在PI3K/AKT信号通路，依次为SRC、EGFR、HSP90AA1、IGF1、HRAS、MAPK14、ESR1、CASP3、PTK2。结论 CUR联合BBR可能通过多靶点和多途径的方式协同改善DILI，为阐明两药合用抗DILI的作用机制研究提供理论依据。

[关键词] 姜黄素；小檗碱；药物性肝损伤；网络药理学；对乙酰氨基酚

[中图分类号] R285      [文献标识码] A    [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.12.017

Prediction of potential mechanism of curcumin combined with berberine in improving drug-induced liver injury based on network pharmacology

WANG Jiale， LIU Yue， MAO Xu

School of Pharmacy， Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China

[Abstract] Objective The potential mechanism of curcumin （CUR） combined with berberine （BBR） in improving drug-induced liver injury （DILI） was preliminarily predicted by a method of in vivo experiment in combination with network pharmacology. Methods The animal model was established by acetaminophen （APAP）-induced DILI and the levels of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） were detected in serum of mice. The network pharmacological approach was used to collect related targets of CUR， BBR， and DILI; Wayne mapping was carried out to screen intersection targets， followed by establishment of a protein-protein interaction （PPI） network of CUR-BBR-DILI. Functional enrichment analysis of gene ontology （GO） and pathway enrichment analysis of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） were conducted finally. Results The in vivo experimental results showed that the combination of CUR and BBR can significantly reduce the serum ALT and AST levels in mice， which is better than administration alone; Network pharmacology experiment results exhibited that 291 related targets of CUR and 208 related targets of BBR were collected by PharmMapper database， and 904 related targets of DILI were collected by Genecards database; 77 intersection targets were screened by Venny 2.1.0 database; 52 gene functions and 20 signal pathways possibly in connection with the improvement of DILI via drug combination were obtained by GO and KEGG analysis， respectively; nine of the top ten core targets according to degree in PPI network were enriched to PI3K/AKT signaling pathway， which were in order as follows： SRC， EGFR， HSP90AA1， IGF1， HRAS， MAPK14， ESR1， CASP3， and PTK2. Conclusion DILI might be synergistically improved by CUR combined BBR through multi-target and multi-pathway manner， providing a theoretical basis for the elucidation of the mechanism of drug combination against DILI.

[Key words] Curcumin; Berberine; Drug-induced liver injury; Network pharmacology; Acetaminophen

隨着药物种类越来越多，药物性肝损伤（drug- induced liver injury，DILI）的发病率也逐年升高。对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是导致DILI最常见的药物之一，临床上主要用于解热镇痛，其在治疗剂量下安全有效，而超剂量服用极易引起严重肝损伤[1]。目前，N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是APAP诱导DILI的唯一解毒剂，但因其治疗窗窄而使用受限，故寻找DILI的有效防治药物具有重要意义[2]。

姜黄素（curcumin，CUR）（图1）为姜黄（Curcuma longa L.）等中药材的主要有效成分，小檗碱（berberine，BBR）（图1）为黄连（Coptis chinensis Franch.）等中药材的主要有效成分，二者均具有抗炎、抗氧化等药理活性[3-4]；还可经多途径改善APAP诱导DILI[5-6]。中药联用是中医治疗的常用策略，而中药起效的物质基础往往是其主要有效成分，已有大量研究表明中药有效成分联用比单用具有更好疗效，而关于CUR联合BBR的研究也早有报道[7-9]。前期研究发现，CUR与BBR联合对db/db小鼠糖脂代谢紊乱及大鼠非酒精性脂肪肝的改善作用均优于单独给药[8-9]。基于以上研究背景，笔者推测CUR联合BBR可能对DILI具有协同保护作用。

网络药理学是一种融合系统生物学和多向药理学预测药物分子作用靶点的科学方法，利用计算机网络将复杂的药物-靶点-疾病间的关系可视化，对于理解药物联合应用多靶点调控的作用机制具有重要意义[10]。本研究将考察CUR联合BBR对DILI的保护作用，并借助网络药理学方法初步探究其潜在作用机制，为二者协同保肝作用的深入研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1  药品与试剂

CUR（色谱纯≥99.0%，批号：20051404）与BBR（色谱纯≥98.0%，批号：21110803）购自成都普菲德生物技术有限公司；NAC（色谱纯≥99.0%，批号：B2218184）购自赛恩生物试剂有限公司；羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na，批号：151826）购自赛信生物科技开发有限公司；APAP（批号：J0625B）购自百杰斯生物公司；0.9%生理盐水（批号：C23020724）购自辰欣药业股份有限公司。

1.2  实验动物

无特定病原体雄性ICR小鼠（6～8周龄）28只，体质量（20±2）g[实验动物许可证编号：SCXK（黑）2019-003]，饲养于牡丹江医学院比较医学中心[实验单位使用许可证编号：SYXK（黑）2019-006]，模拟昼夜光照，自由摄食饮水，温度为（22±2）℃，相对湿度为（50±5）%。本研究经牡丹江医学院动物伦理委员会审批通过（伦理审批号：20220629-33）。

1.3  动物分组及造模

小鼠适应性饲养1周后，随机分为空白对照组、APAP组（腹腔给予400mg/kg的APAP）、CUR组（灌胃给予100mg/kg的CUR）、BBR组（灌胃给予100mg/kg的BBR）、CB-H组（同时灌胃给予100mg/kg的CUR和100mg/kg的BBR）、CB-L组（同时灌胃给予50mg/kg的CUR和50mg/kg的BBR）、NAC组（腹腔给予100mg/kg的NAC），每组4只。预防组小鼠（CUR组、BBR组、CB-H组、CB-L组）连续给药5d，1次/d，空白对照组、APAP组、NAC组同法给予等量溶剂（0.5% CMC-Na溶液）。除空白对照组外，其他各组小鼠于给药第5天后给予APAP建立DILI模型，其中NAC组小鼠在APAP诱导前1h给予NAC溶液，所有小鼠在APAP处理24h后眼球采血。

1.4  小鼠血清生化指标检测

将各组小鼠血样离心（3000转/min）15min得血清，送至牡丹江医学院附属红旗医院检验科检测丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）与天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.5  统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理分析。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用t检验。P <0.05为差异有统计学意义。

1.6  网络药理学分析

1.6.1  药物靶点的搜集  通过PharmMapper数据库搜集CUR和BBR的相关靶点，应用Uniprot数据库将所得靶点转化成基因格式。

1.6.2  疾病靶点的搜集  通过Genecards数据库搜集DILI的相关靶点，应用Uniprot数据库将所得靶点转化成基因格式。

1.6.3  交集靶点的收集  将CUR、BBR、DILI对应靶点进行映射，利用Venny 2.1.0数据库绘制韦恩图，得到交集靶点。

1.6.4  蛋白质-蛋白质互作网络的构建  将所得交集靶点导入String数据库，构建交集靶点的蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interactions，PPI）网络，利用Cytoscape3.10.0软件进行可视化处理，根据度值排序，筛选出核心靶点。

1.6.5  基因本体功能富集分析  通过Metascape数据库对PPI网络筛选出的核心靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析，并利用微生信在线平台对富集结果进行可视化处理，得到CUR联合BBR改善DILI主要涉及的生物进程、分子功能及细胞组分。

1.6.6  京都基因与基因组百科全书通路富集分析 通过Metascape数据库对PPI网络筛选出的核心靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并利用微生信在线平台对富集结果进行可视化处理，得到CUR联合BBR改善DILI的主要信号通路。

2  结果

2.1  小鼠血清生化指标的检测结果

与空白对照组相比，模型组小鼠血清ALT与AST水平显著升高（P<0.01），见图2，表明APAP已成功诱导DILI；与模型组相比，各预防组小鼠血清ALT与AST水平均显著降低（P<0.05），表明CUR与BBR可改善APAP诱导DILI；与CUR或BBR单独给药组相比，联合给药组（CB-H组和CB-L组）效果更显著（P<0.05），尤其是联合给药低剂量组已接近阳性对照组（NAC组）。该结果表明CUR联合BBR可增強对APAP诱导DILI的保护作用，具有协同效果。

2.2  药物与疾病相关靶点的搜集

2.2.1  CUR与BBR相关靶点的搜集  经PharmMapper数据库筛选，CUR得到291个相关靶点、BBR得到208个相关靶点。

2.2.2  DILI相关靶点的收集  经Genecards疾病数据库筛选，DILI得到904个相关靶点。

2.3  药物与疾病靶点的韦恩映射

将CUR、BBR、DILI相关靶点进行韦恩映射，经Venny 2.1.0数据库筛选，得到77个交集靶点，见图3。

2.4  CUR-BBR-DILI的PPI网络构建及核心靶点获取

将上述77个交集靶点导入String数据库，设置筛选条件后共获得77个节点和223条边。通过Cytoscape软件将PPI网络可视化，见图4。

对PPI网络中所有节点的拓扑参数进行分析，得到核心靶点，见表1。度值较大的靶点有：度值=23的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种细胞膜受体信号系统的跨膜激酶受体，在肝细胞中高度表达[11]；度值=19的白蛋白（albumin，ALB）是人体血浆中最主要的蛋白质，由肝脏合成[12]；度值=19的丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）广泛参与细胞分化、增殖、凋亡等生物过程[13]；雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、胱天蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、信号传导及转录激活蛋白1（signal transducer and activator of transcription1，STAT1）等也均为DILI各阶段的关键靶点[14-15]。

2.5  GO与KEGG分析

利用Metascape数据库对PPI网络筛选出的77个交集靶点进行GO与KEGG分析。GO分析确定了52个功能条目，见图5，结果显示CUR联合BBR可能主要影响激素应答与激酶活性调控等生物进程、核受体活性与羧酸结合等分子功能、囊腔与膜筏等细胞组分，进而对DILI起协同保护作用。

KEGG分析确定了20条通路，见图6，结果显示CUR联合BBR可能主要作用于PI3K-AKT信号通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、PPAR信号通路等，进而对DILI起协同保护作用。

综合GO与KEGG分析结果，DILI的发生和发展可能与体内多个生物过程和多条信号通路有关，表明CUR联合BBR协同改善DILI具有多途径和多靶点的特性。

3  讨论

DILI是临床急性肝损伤最常见的诱因之一，严重者可致肝衰竭并危及生命。目前已发现上千种药物可导致DILI，但其防治选择却相当有限，因此寻找安全有效的药物十分必要[2，16]。研究发现CUR与BBR具有改善DILI的药理活性，但二者的生物利用度差，故临床使用受限[5-6，17-18]。中药联用是中医治疗的常用策略，其可通过多成分和多靶点间的相互作用产生协同疗效，故推测CUR联合BBR对DILI的改善作用可能优于单独给药[19]。本研究以APAP作为诱导DILI的模型药物，通过体内实验证实两药联用对DILI具有协同保护作用，但机制尚不清楚。

网络药理学是一种将生物信息学与传统药理学相结合的新方法，本研究借助网络药理学挖掘CUR联合BBR改善DILI的潜在作用机制[20]。本研究通过PharmMapper数据库搜集到CUR相关靶点291个、BBR相关靶点208个，Genecards数据库搜集到DILI相关靶点904个；随机将这些相关靶点进行韦恩映射，利用Venny 2.1.0数据库筛选到77个交集靶点，并进一步将这些交集靶点导入String数据库构建PPI网络获取核心靶点信息；最后对这些交集靶点进行GO与KEGG分析，分别获得52条功能条目和20条信号通路。52条功能条目主要富集在激素应答、激酶活性调控等多个生物过程；20条信号通路中富集程度最高且与肝损伤相关的信号通路为PI3K/AKT信号通路[21-23]；PPI网络中度值排名前10的核心靶点有9个富集到该信号通路中，依次为SRC、EGFR、HSP90AA1、IGF1、HRAS、MAPK14、ESR1、CASP3、PTK2。研究发现PI3K/AKT信号通路与APAP诱导DILI和早期肝再生的发生有关，推测CUR联合BBR可能主要作用于该通路改善DILI[24]。此外，CUR联合BBR还可能通过HIF-1、PPAR等信号通路发挥保肝作用。

综上，CUR联合BBR对DILI具有协同保护作用，可能与多种基因功能和多条信号通路有关，本研究为深入阐明两药协同抗DILI的作用机制奠定基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2023–09–12）

（修回日期：2024–04–04）