72种单方中草药对乌鳢源维氏气单胞菌的体外抑菌效果

孙云贵 李泽昱 强璐 高迎莉

摘要：为筛选出抑制乌鳢源维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）的单方中草药，结合了前人研究结果及《水产养殖用药明白纸2022年2号》中规定使用的中草药，挑选了73种中草药，通过煎煮法制备中草药提取液，筛选抑菌圈>10 mm的中草药；进而测定中草药的最小抑菌质量浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC）。研究结果表明，诃子（Chebulae Fructus）、五倍子（Galla chinensis）、五味子（Schisandrae chinensis）、乌梅（Mume Fructus）、地锦草（Euphorbiae humifusa Herba）和酒萸肉（Corn：Fructus）的抑菌效果最好，对10株维氏气单胞菌的抑菌圈直径均在10 mm以上，高度敏感率为55%；MIC≤62.5 mg/mL，在所有MIC中的占比为85%；MBC≤125 mg/mL，在所有MBC中的占比为90%。地榆（Sanguisorba Radix）和丁香（Caryophylli Flos）等25种中草药对维氏气单胞菌有抑菌作用；使君子（Quispualis Fructus）和雷丸（Omphalia）等47种中草药无抑菌作用。以上结果显示，诃子等6种中草药对乌鳢源维氏气单胞菌具有明显抑菌和杀菌活性，可作为防控维氏气单胞菌的用药参考。

关键词：维氏气单胞菌；中草药；抑菌；最小杀菌质量浓度

中图分类号：S948；S182  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）08-0157-09

收稿日期：2023-06-01

基金项目：江苏省政策引导类计划（苏北科技专项）（编号：SZ-LYG202133）；江苏省高等学校基础科学（自然科学）研究面上项目（编号：22KJB240001）；江苏省生物技术重点实验室开放基金（编号：HS2020003）；江苏省优势学科建设项目。

作者简介：孙云贵（1998—），男，山西晋中人，硕士研究生，主要从事水产动物病害与免疫研究。E-mail：Sunyungui@outlook.com。

通信作者：高迎莉，博士，講师，主要从事水产动物病害与免疫研究。E-mail：yingli.gao@jou.edu.cn。

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）在水生环境和陆生环境中分布非常广泛［1］。据报道，维氏气单胞菌可引起多种水生动物溃烂病及牲畜和人类的腹泻，给水产养殖业造成经济损失，也严重影响了人类健康［2］。

目前，国内外对水产养殖动物疾病预防和治疗策略主要还倾向于使用抗生素和化学品，但药物残留、环境微生态平衡破坏及细菌耐药性的问题已对水产养殖业产生影响［3］。2023年2月，我国农业农村部发布的《春季水产技术指引》中规定“严禁抗生素滥用”；同年3月，农业农村部发布的《农业农村部办公厅关于做好2023年水产绿色健康养殖技术推广“五大行动”工作的通知》中提到“骨干基地要实现用药量、特别是抗生素使用量同比持续降低”。因此，为响应政府号召，做好绿色健康养殖，寻找替代抗生素的治疗药物和策略迫在眉睫。

近年来，人们对食品安全的关注程度逐年增加，人们越来越趋向于天然产品的消费。国家统计局数据表明，2021年中草药及中成药类成交额达 1 855.30 亿元，并且在2013—2021年间中草药及中成药类成交额一直处于上升趋势，具有良好的增长潜力［4］。“中草药”一词最早出现在《神农本草经》中，最初中草药用于治疗人类的疾病，之后发展到治疗动物疾病。近年来，中草药被广泛应用于水产疫病防控中［5-8］，使用绿色、低廉的中草药治疗水产动物疾病已成为一种趋势。罗非鱼（Oreochromis niloticus GIFT strain）饲喂苦参含量为0.1%的饲料后，无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）攻毒后的死亡率仅为21.1%，相对存活率为73.3%，表明苦参对无乳链球菌有很强的抑菌效果［9］。野鲮（Labeo victorianus）抗嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的研究中发现，野鲮的存活率会随着饲料中荨麻（Urtica fissa）细粉的含量增加而增加，饲料中荨麻细粉添加到5%时，野鲮的存活率达95%［10］。东北林蛙（Rana dybowskii）饲喂含 0.2 kg/kg中草药提取物的活饵5～6 d后，采用嗜水气单胞菌对其进行攻毒，对照组在攻毒后9 d全部死亡，红花（Carthamus tinctorius）组和五倍子（Galla chinensis）组在攻毒 11 d 后死亡情况趋于稳定，存活率分别为55%和35%，抑菌效果明显［11］。拟穴青蟹（Scylla paramamosain）在浓度为20 mg/L的五倍子溶液中药浴3 d后，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）攻毒后的最终存活率为40%，存活的螃蟹表现出敏捷的活力，而对照组的死亡率在5 d达100%［12］。综上所述，中草药可作为疫苗、抗生素或化学药品的有效替代品，在治疗和预防水产养殖动物等方面显现出非常广阔的应用前景，也使人类能够获得更安全的水产养殖产品。

本研究通过煎煮法制得诃子（Chebulae Fructus）等73种中草药提取液，分别测定了72种中草药提取液对不同来源的维氏气单胞菌的体外抑菌圈大小、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），筛选出能够抑制维氏气单胞菌的单方中草药，研究结果旨在为乌鳢源维氏气单胞菌引起疾病的临床治疗提供理论依据，同时为中草药对乌鳢溃烂病的预防和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂 LB营养琼脂和LB营养肉汤（青岛海博生物技术有限公司）；96孔板和8 mm打孔器及其他试验所需材料，均购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.2 供试菌株 不同株的乌鳢源维氏气单胞菌见表1，由江苏海洋大学江苏海水养殖动物病害重点实验室提供，2022年5月分离鉴定。在超净工作台中，划线接种，培养24 h（28 ℃），挑单菌落于1.5%无菌生理盐水中，采用紫外分光光度计将浓度调整为1.0×107 CFU/mL，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 中草药液的制备 鸡血藤、乌梅、丁香、艾叶、大黄、黄柏、穿心莲、鱼腥草、黄连、大青叶、黄芪、柴胡、青蒿、侧柏叶、苦参、玄参、鹤虱、板蓝根、山豆根、陈皮、川楝子、桔梗、熟地黄、酒萸肉、白头翁、山药、车前子、牡丹皮、茯苓、龙胆、厚朴、石膏、五味子、知母、五倍子、当归、黄药子、百部、栀子、玄明粉、浙贝母、绵马贯众、虎杖、黄芩、淫羊藿、茵陈、地锦草、甘草、仙鹤草、诃子、苏木、辣蓼、槟榔、地榆、石榴皮、常山、使君子、木香、苍术、郁金、连翘、半夏、金银花、青黛、益母草、苦谏树皮、丹参、山楂、麦芽、雷丸、蒲公英和博落回等72种中草药（表2），均购于安徽亳州中药材市场。

2022年11月，在江苏海洋大学水产动物病害与免疫学实验室分别取研磨至约100目的中草药超微粉剂10 g， 加200 mL蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌30 min，使药粉与水充分混合，然后浸泡2 h，4 000 r/min 离心10 min，取上清采用滤纸过滤，取滤液加热浓缩至10 mL，8 000 r/min离心10 min，取上清制成1 000 mg/mL的药液，121 ℃高温灭菌，4 ℃ 保存。此方法用于体外抑菌圈试验，减小工作量，已达快速筛选的目的。

取初步筛选的中草药超微粉剂20 g，加400 mL蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌30 min，使药粉与水充分混合后，浸泡2 h，大火煮沸改小火熬制30 min，4 000 r/min 离心10 min，收集滤液，重复3次。将收集得到的滤液加热浓缩至20 mL，8 000 r/min离心10 min，取上清制成1 000 mg/mL的药液，高温灭菌后，4 ℃保存备用。此方法用于测定中草药的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。

1.2.2 药物敏感性测定 采用琼脂扩散法测定药物敏感性［13］，取维氏气单胞菌悬液0.1 mL，涂布于厚度为8 mm LB营养琼脂培養基，采用打孔器打孔（孔径为8 mm，每个培养基打4个孔，3个孔为生物学重复，1个孔为阴性对照），加100 μL LB营养琼脂封底，试验孔加入0.1 mL中药原液；28 ℃正置培养24 h，以3个不同角度测定抑菌圈直径。根据研究方法［14］规定，判断抑菌圈。

1.2.3 单方中草药MIC和MBC测定 参照夏与晴等的方法［15］，测定乌梅、五倍子、五味子、诃子、地锦草和酒萸肉（抑菌圈直径>10 mm）的MIC和MBC。无菌条件下，8个离心管分别加入300 μL LB肉汤，后在第1管中加入300 μL待测中药混匀，接着2倍比稀释至第8管，每管液体终体积300 μL。96孔酶标板见图1，各孔加入上述配制好的溶液100 μL。A～H行药液浓度分别为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91 mg/mL。1～3列的A～H行加入菌悬液10 μL，作为试验组；第4～6列（A～B行）加入肉汤作为空白对照组，观察是否有细菌生长；第4～6列（C～D行）加入 50 μL 肉汤和50 μL待测药液，作为阴性对照；第4～6列（E～F行）加入10 μL菌液，作为阳性对照（细菌是否正常生长）；采用保鲜膜包裹，28 ℃培养18～24 h后，每孔吸取50 μL待测溶液进行涂布并培养18 h（倒置）。根据前人试验的观察结果［16］判定，试验组与空白对照组的透明度相同的浓度，即为待测中草药的MIC。

取高于MIC浓度的96孔中的混合液涂布，培养18 h，少于5个单菌落的浓度即为待测中草药的MBC。

2 结果与分析

2.1 制取工艺影响

由图2可知，2种制取工艺制得的中草药液间的抑菌圈大小，SPSS数据分析结果表明，2种方法的抑菌圈直径差异不显著（P>0.05）。

2.2 73种中草药液体外抑菌效果

由表3可知，25种中草药对维氏气单胞菌具有抑菌效果，其他47种单方中草药无抑菌效果。结果显示，五倍子对菌株C的作用极强（+++），抑菌圈直径为 21 mm；诃子等22 种中草药对不同菌株存在中等强度或以上的抑菌效果，其中，诃子、地锦草、五倍子、酒萸肉、乌梅和五味子对所有菌株均有中等或以上的抑菌强度（+），抑菌圈直径为11～21 mm；受试菌株对侧柏叶等50种中草药提取物不敏感，抑菌圈直径均<10 mm。

2.3 MIC和MBC的测定结果

由表4可知，诃子、五倍子、乌梅、五味子和酒萸肉对10株受试菌株的MIC多数在31.25～62.50 mg/mL 之间，其中，五倍子和乌梅对菌株12的MIC最低，浓度为15.63 mg/mL，五味子对菌株10的MIC最高，浓度为250 mg/mL；地锦草除了对菌株C和菌株2F1的MIC为31.25 mg/mL外，对其他菌株的MIC均在125.00～500.00 mg/mL之间。

3 讨论

3.1 中草药提取工艺

目前， 实验室提取中草药液的方法主要是煎煮法，优点是对设备的要求低，但筛选过程耗时长，工作量大。因此，本研究在煎煮法的基础上做了一些改进，采用了中草药的超微粉剂，并采用磁力搅拌的方法加速中草药与水混合，获取滤液用于中草药抑菌圈试验，相比传统的煎煮法的提取效率显著增加。

3.2 中草药抑菌效果

研究表明，抗生素主要通过抑制细胞壁的合成、与细胞膜相互作用等机制发挥抗菌的作用，对细菌选择压力大，易诱导细菌产生耐药性［17］。而中草药的抑菌和杀菌机制是其中的有效成分作用于细菌的致病因子，减少细菌的抗药性和致病能力，同时促进机体的免疫应答，从而起到抑制及杀灭细菌的效果。所以，中草药抑菌的主要机制是直接抑菌作用和增强免疫应答［18］。中草药抑菌大大降低了细菌的选择压力， 不易产生耐药性［19］。因此， 研究中草药的抑菌效果具有重要意义。

王宝屯等的研究结果显示，乌梅、苏木、五倍子、丁香和艾叶对花鲈（Lateolabrax maculatus）源维氏气单胞菌具有较强的体外抑菌效果（抑菌圈直径在15～25 mm之间），MIC<125 mg/mL，且MBC<500 mg/mL［20］。朱成科等研究发现，单方中草药五倍子、石榴皮、地榆和乌梅对黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）源维氏气单胞菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径>20 mm，其中，五倍子抑菌和杀菌作用最强（MIC和MBC均为1.95 mg/mL）；地榆次之，MIC为1.95 mg/mL，MBC为3.91 mg/mL［21］。张恒桥等发现，五倍子、黄芩、地榆、诃子、黄连和苏木等6种中草药对昆明裂腹鱼（Schizothorax grahami）源维氏气单胞菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径介于18～22 mm，其中，五倍子抑菌和杀菌效果最好（MIC和MBC分别为1.95 mg/mL和3.19 mg/mL）；诃子、苏木、黄芩次之，均为3.19 mg/mL和7.81 mg/mL；黄连和地榆均为7.81 mg/mL和15.63 mg/mL［16］。本研究表明，72种中草药中有22种中草药对乌鳢源维氏气单胞菌具有明显的抑菌作用（中等强度及以上），其中，对10株菌均有抑菌效果的中草药有6种，分别是诃子、酒萸肉、五倍子、乌梅、地锦草和五味子，且均具有中等强度或以上的抑菌作用；6种中草药的MIC和MBC结果表明，MIC≤62.5 mg/mL，在所有MIC中的占比为85%；MBC≤125 mg/mL，在所有MBC中的占比为90%；有些中草药对个别菌株也表现出了较好的抑菌效果，如地榆对菌株12和菌株C的抑菌圈直径分别为19 mm和18 mm；丁香对菌株C的抑菌圈大小为19 mm，也具有中等强度的抑菌作用。通过比较6种中草药对同一菌株的MIC和MBC，发现两者间的数值相同或呈二倍关系，原因可能是中草药水提液较为浑浊，而肉眼观察其透明度会存在一定误差。

中草药体外抑菌的试验方法借鉴于抗生素敏感试验方法，该方法研究抑菌效果的同时，也带来诸多问题［22］。中草药定性试验采用琼脂扩散法可简单、快速地筛选出具有抑菌效果的中草药，但准确度不高，存在人为因素导致的误差。中草药定量试验采用稀释法虽可测定中草药对细菌的MIC和MBC，获得最基本的药效学数据，但中草药的有效成分复杂，主要是通过调节机体平衡、增强免疫力来治疗疾病，因此，往往会出现体外抑菌效果差的中草药，在体内却能发挥较好的抑菌作用［23］。因此，本研究将定性和定量试验相结合，尽可能全面评估不同单方中草药的抑菌效果。本研究中的诃子、五倍子、乌梅和五味子在上述研究中均有提到，表明这些中草药的抑菌效果较强、抗菌谱广。本研究通过定性方法从《水产养殖用药明白纸2022年2号》筛选出具有抑菌效果的中草药，均可进一步用于鱼体研究，对寻找具有良好药效的中草药及研究中草药组方合剂具有重要的研究价值，旨在为防治维氏气单胞菌引起的水产动物疾病提供参考。

3.3 不同菌株对中草药的敏感程度

在实际的生产实践中，引起水产养殖动物暴发疾病的病原菌的不同分离株对中草药的敏感程度也会存在差异［24-25］，因此，研究中草药对同一细菌不同分离株的抑制效果，有助于筛选出抗菌谱广的中草药，对水产疫病的防控具有重要意义。在前期的研究中，在实验室从患病鱼体的不同部位及水体中分离出了10株不同的维氏气单胞菌，抑菌试验筛选出的6种中草药对不同位置分离的维氏气单胞菌均表现出了中等以上的抑菌效果。然而，同一种中草药对不同分离株的抑菌效果仍存在较大差异。本研究结果显示，鱼体中分离菌株对中草药的高度敏感率（56%）高于水体中分离的菌株（50%），其中，眼部分离株的高度敏感率（91.7%）显著高于水体中分离株，并且水体中分离菌株的MIC和MBC与其他试验组相比均处于最高值。在周光等的抗生素药敏试验中，外环境分离菌株的敏感率高于鱼体分离的菌株［26］。本研究结果与之相反，原因可能是鱼体内药物使用造成的体内菌株耐药性增加。目前，单方中草药体外抑菌试验多针对一种细菌的某一分离株或不同种类的多株细菌进行研究，而对同一种菌的不同分离株同时进行中草药体外抑菌试验的研究较少。

3.4 中草药活性成分

随着中草药在水产动物疫病防控方面的應用越来越广，进一步研究中草药的作用机理将成为今后研究的重点。研究表明，中草药的抑菌效果主要与其中的活性成分有关，其主要分为15大类：黄酮类、生物碱类、葡萄糖苷类、糖苷类、精油类、树脂类、光敏色素类、有机酸类、氨基酸类、单宁类、蛋白质类、酶类、微量元素类、多糖类和矿物盐类［27］。

诃子中含有酚类、黄酮类和有机酸类等活性成分［28］。Reddy等发现，诃子鞣酸可抑制脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞产生的炎症反应；诃子有效成分中的没食子酸甲酯对志贺氏菌（Shigella）的最小抑菌浓度范围为128～256 μg/mL、最小杀菌浓度为256～512 μg/mL，抑菌效果明显［29-30］。本研究结果中，诃子对多数维氏气单胞菌具有高等强度的抑菌作用，MIC和MBC范围均在31.25～62.50 mg/mL 之间，表明诃子的抗菌谱广，在实际应用中可适当调整诃子水提物的浓度，提高其中有效成分含量，达到预防和治疗疾病的效果。

五倍子药用范围广，其活性成分可以分为三萜类、黄酮类、精油类、有机酸类、类固醇类和木脂素类等6大类［31］。Wei等研究发现，五倍子中的没食子单宁能够通过抑制NF-κB信号来减少结肠炎症［32］；郑梦珍等从五倍子粗提物中分离出的五倍子活性组分均能显著抑制无乳链球菌的生长［33］。五倍子常用于治疗皮肤溃烂和腹泻［34］。结合本研究结果发现，溃烂灶处分离的菌株12对五倍子高度敏感，且MIC（15.63 mg/mL）明显低于其他试验组，推测五倍子中的有效成分对引起溃烂病的细菌抑制作用强。

乌梅中含有大量的有机酸类、糖类和维生素类成分［35］。乌梅提取物中的咖啡酸、香豆酸和原儿茶酸等酚酸类活性物质可降低肠道的炎性反应［36］。乌梅醇提物能明显抑制细菌和真菌的生长，其中，分离的有机酸对金黄色葡萄球菌（Streptococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）等细菌有显著的抑制效果［37］。乙醇体积分数为95%、料液比（g ∶mL）为1 ∶25、超声波提取时间60 min及提取频率为 100 kHz 等条件下，乌梅有机酸的提取率最高（12.17%），对枯草杆菌（Bacillus subtilis）和大肠杆菌等具有显著的抑制效果。本研究结果显示，乌梅对鱼体分离菌株的MIC和MBC在15.63～31.25 mg/mL 之间，抑菌和杀菌效果显著高于其他5味中草药，这与王宝屯等的研究结果［20］一致。推测与乌梅提取物中的有机酸含量有关。

五味子的活性物质主要有木脂类、三萜类、酚酸类、黄酮类和植物甾醇等［38］。五味子醇提取物能降低促炎症细胞因子的分泌，增强抗氧化能力，达到抑制肠道炎症反应的效果［39］；此外，五味子叶片提取物比果实提取物具有更好的抗氧化和抗菌活性，主要原因是叶片提取物中的酚酸含量更高［40］。地锦草中含有黄酮及其苷类、酚酸和鞣质类、萜类和生物碱类等化学成分［41］。地锦草中丰富的酚类化合物，可抑制NO和TNF-α产生而达到抗炎症反应的效果［42］；其次，地锦草乙酸乙酯提取物中的木犀草素、槲皮素、山柰酚等主要活性物质可破坏金黄色葡萄球菌的细胞完整性及增加细胞膜的通透性，抑制生物膜的合成，从而达到抗菌的功效［43］。酒萸肉有生物碱类等多种活性物质［44］。酒萸肉的黄酮类、酚酸类和环烯醚萜类活性物质对细菌具有很强的抑制作用，抑菌效果会随着没食子酸和阿魏酸浓度的增加而增加［45-46］。本结果显示，五味子、地锦草、酒萸肉的抑菌圈直径多数在11～15 mm之间，MIC和MBC大多在62.5～125.0 mg/mL之间，与其他3味中草药相比，抑菌效果较差，但它们发挥抗炎和抑菌作用均与酚酸类活性成分有一定关系。

综上所述，本研究中筛选出的6种中草药对乌鳢源维氏气单胞菌均有中度以上的抑菌效果，综合以往研究结果，6种中草药的提取物均有降低炎性反应的作用且6种中草药的抑菌效果多由酚类化合物的含量决定，因此，推测这6种中草药对维氏气单胞菌产生抑菌效果可能与其对炎症的抑制效果有关，以及推测酚类化合物可能是抑制维氏气单胞菌的重要活性成分之一。

4 结论

从72种中草药中筛选出25种对乌鳢源维氏气单胞菌具有抑菌作用的中草药；其中，诃子、地锦草、五倍子、乌梅、酒萸肉和五味子对10株维氏气单胞菌均表现出较强的抑菌和杀菌活性，表明诃子等6种单方中草药可作为防控维氏气单胞菌的用药参考。

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