西康扁桃仁中β-谷甾醇检测方法的建立

朱子冬 李仁爱 鲁泽立 程潇潇 田荣荣

摘  要：

西康扁桃仁中植物甾醇含量丰富，且以β-谷甾醇为主。通过高效液相色谱法检测波长、流动相配比、流速、柱温等条件，确定西康扁桃仁中β-谷甾醇含量测定的最佳条件为检测波长201 nm，流动相为100%甲醇，流速1.0 mL/min，色谱柱温度40℃。方法学考察结果表明，该方法线性关系良好，精密度、重复性及稳定性的RSD值均小于2.0%，平均加标回收率106.14%，该方法稳定可靠，可用于西康扁桃仁中β-谷甾醇的含量测定。

关键词：西康扁桃仁；β-谷甾醇；高效液相色谱法；含量测定

中图分类号：TS207.3

文献标识码：A  文章编号：1673－4513（2024）－02－102－06

收稿日期：2023年03月12日

作者简介：

朱子冬（1996-），男，北京人，助理实验师，学士，主要研究方向：食品质量检测技术。

通信作者：

田荣荣（1982-），女，山东荣成人，教授，博士，主要研究方向：食品质量与安全。

基金项目：

北京城市学院大学生创新创业项目（202211418019）。

引言

西康扁桃（Amygdalus tangutica （Batal.） Korsh.） 又名四川扁桃、甘肃山毛桃等，蔷薇科［1-2］，密生落叶小灌木，主要产自甘肃南部和四川西南部，是唯一分布在我国南方的野生扁桃种［3］。作为我国特有的木本油料植物，西康扁桃同时还是一种重要的天然食品添加剂及医药原料，具有很高的开发潜力。

植物甾醇是一种植物中存在的甾体化合物，几乎所有的植物性食物中均有分布。至今已发现的植物甾醇的种类数量超过250种，它们遍及各种植物性食物，含量最多且最为普遍的是豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇以及菜油甾烷醇 ［4］。植物甾醇不但抗氧化活性强，同时具有抑制胆固醇的吸收、降低血脂免疫调节作用等多种生理功效［5］。西康扁桃仁中植物甾醇含量超过300 mg/100g，其中β-谷甾醇含量丰富，占80%左右［3］。

β-谷甾醇是以环戊烷全氢菲为基本骨架的四环三萜类化合物，其分子结构与胆固醇相近，主要区别在C-17及C-24上的结构，导致两者具有不同的生理活性。作为重要的天然甾醇资源，β-谷甾醇具有消炎、抗氧化、降血压、降血脂等多种药理活性和生理功能［5-6］。目前，β-谷甾醇的含量测定方法主要有双波长薄层扫描法［7］、薄层色谱扫描法、高效液相色谱-ELSD［8］、高效液相色谱法等［9-10］、气相色谱法［11］等。其中高效液相色谱法操作简便，只需皂化和萃取等手段，即可直接进样，无需对样品进行衍生化，同时具有灵敏度高，准确度高、稳定性好等优点，应用较广。本实验拟建立一种简单、快捷的高效液相色谱法对西康扁桃中β-谷甾醇含量进行测定，为西康扁桃种质资源的充分利用提供方法学支持。

一、实验材料及仪器

（一）实验材料及试剂

实验中所使用的西康扁桃由林科院提供，采自四川省阿坝州松潘县，取仁，冷藏。

β-谷甾醇标准品（HPLC≥99%），北京索莱宝科技有限公司。

乙酸乙酯，北京市通广精细化工公司；无水乙醇，北京市通广精细化工公司；95%乙醇，江苏强盛功能化学股份有限公司；氢氧化钾，北京化学试剂公司；甲醇，北京西胧科学股份有限公司；其中甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

西康扁桃仁中β-谷甾醇检测方法的建立

（二）实验仪器

CTO-16高效液相色谱仪，岛津仪器（苏州）有限公司；色谱柱为C18 Inertsil ODS-3（4.6 nm × 250 nm， 5 μm）；98-I-B型电子分析天平梅特勒-托利多仪器有限公司；B-260电热恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；MDF-86V340 -20℃冰箱，中科都菱科技有限公司；DL-101-2电热恒温鼓风干燥箱，天津中环实验电炉有限公司；200多功能粉碎机，武义意中厨具有限公司；KQ5200DB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

二、实验方法

（一）标准品溶液的制备

精密称取β-谷甾醇对照品10 mg，置于10 mL容量瓶，加入甲醇超声溶解，并定容至刻度线，用有机微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取滤液，得1.0 mg/mLβ-谷甾醇标准品溶液。

（二）样品溶液的制备

西康扁桃仁去皮干燥粉碎，加入定量的乙酸乙酯，超聲提取后获得扁桃仁油，称取适量扁桃仁油于三角瓶中加入浓度为20%的氢氧化钾-乙醇溶液，随后水浴加热使其皂化，萃取得到植物甾醇粗提物，并加适量流动相溶解残渣，得供试品溶液。

（三）β-谷甾醇检测条件的摸索

1.检测波长的选择

配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇标准品溶液。使用TU-1900紫外分光光度计，设置扫描波长为190 nm ～ 300 nm，对标准品进行全波长扫描，根据吸光值的变化，确定β-谷甾醇的检测波长。

2.流动相的选择

配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇标准样品溶液，分别设置流动相为100%甲醇，甲醇一水的比例为955，甲醇一水的比例9010，选用二（三）1确定的检测波长，流速为1.0 mL/min，柱温设为35℃，进样量为10 μL，根据样品的保留时间及峰型，确定流动相配比。

3.流速的选择

配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇标准样品溶液，选用二（三）1确定的检测波长及二（三）2确定的流动相，分别以0.8、1.0、1.2 mL/min 的流速分析β-谷甾醇标准样品溶液，柱温设为35℃，进样量为10 μL，根据样品的保留时间及峰型，确定流速。

4.柱温的选择

配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇标准样品溶液选用二（三）1确定的检测波长、二（三）2确定的流动相及二（三）3确定的流速，分别设柱温为30℃、35℃、40℃、45 ℃，进样量为10 μL，根据样品的保留时间及峰型，确定柱温。

（四）β-谷甾醇检测方法的可靠性考察

1.线性关系考察

分别配制浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL的β-谷甾醇标准液。按上述色谱条件检测，考察标准液浓度与峰面积间的线性关系。

2.精密度考察

分别吸取同一对照品溶液，重复进样6次，计算其相对标准偏差，考察该方法的精密度。

3.稳定性考察

取样品溶液，室温下放置0、4、8、12、24 h，分别进样，考察该样品在24 h内室温下的稳定性。

4.加标回收率考察

取样品溶液10份，取其中的一份进行上机检测β-谷甾醇含量，分别配制低、中、高3种不同浓度的标准溶液，加入后9份样品中，按照同样方法上机测定，计算加标回收率。

（五）西康扁桃仁中β-谷甾醇含量的检测

利用二（二）的方法制备样品溶液，利用建立的HPLC检测方法，检测并计算西康扁桃仁中β-谷甾醇的含量。

三、实验结果

（一）β-谷甾醇高效液相色谱条件的摸索结果

1.检测波长的确定

如图1所示，190 nm ～ 300 nm范围内β-谷甾醇的吸光值呈明显的先升高后降低趋势，在波长201 nm处达到最高峰，

A～C 流动相分别为甲醇100%、甲醇水为955、甲醇－水为9010

A～C 流速分别为0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min

故选择波长为201 nm为检测波长。

2.流動相的确定

如图2所示，当流动相为100%甲醇时，出峰时间快，峰宽比较窄，峰型最为对称，因此选择100%甲醇为流动相。

3.流速的确定

如图3所示，当流速为1 mL/min时，出峰时间较快，峰形对称，当流速增加至1.2 mL/min时，虽然保留时间更短，但在检测样品时与其他杂峰无法达到完全分离，因此选择1 mL/min流速最为适宜。

4.柱温的确定

如图4所示，当柱温为40℃时，峰型相对最为对称，出峰时间较快，峰宽比较窄，且检测样品时与杂峰可达到完全分离，因此柱温选择40℃。

A～D 柱温分别为30℃、35℃、40℃、45℃

（二）β-谷甾醇高效液相色谱检测方法的

考察结果

1.线性关系和方法精密度考察结果

图5所示，以β-谷甾醇浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到相关方程y＝5326472x - 42712，相关系数R2为0.9995，说明β-谷甾醇在 20～500 μg/mL内均呈良好的线性关系其回归性较好，可进行β-谷甾醇的定量分析。

如表1所示，同一标准品溶液重复进样6次，平行性较好， RSD值为0.75%，表明该方法精密度良好。

2.样品稳定性考察结果

如表2所示，24小时内检测β-谷甾醇含量差异较小，RSD值仅为1.87%，说明在室温条件下样品24小时内较为稳定。

3.样品加标回收考察结果

如表3所示，加标不同浓度标准品，样品回收率在94.13% ～ 115.73%范围内 ，平均回收率为106.14%。研究表明，该方法回收率良好，可用于样品的测定。

（三）西康扁桃样品中β-谷甾醇含量的测定

采用优化后的液相色谱条件检测西康扁桃仁样品中β-谷甾醇含量，色谱图如图6所示，重复三次，含量平均值为253.56 mg/100g。

结语

本实验采用高效液相色谱法检测西康扁桃仁中β-谷甾醇含量，分别优化了流动相、流速、柱温等色谱条件，并通过线性关系、精密度、稳定性及加标回收等方法学考察，结果表明当检测波长为201 nm，流动相为100%甲醇，流速为1 mL/min，柱温为40℃时，用时较短，线性关系及精密度良好，回收率高，可用于测定西康扁桃仁中β-谷甾醇含量。本实验未对β-谷甾醇的提取条件进行考察，未来可进一步优化提取过程，使西康扁桃仁中β-谷甾醇资源得以更充分地利用。

参考文献：

［1］段义忠， 王佳豪， 王驰， 等.未来气候变化下西北干旱区4种扁桃亚属植物潜在适生区分析 ［J］.生态学杂志， 2020， 39（7）： 2193-2204.

［2］王春成， 张云玲， 马松梅， 等.中国扁桃亚属四种野生扁桃的系统发育与物种分化 ［J］.植物生态学报， 2021， 45（9）： 987-995.

［3］王伟， 许新桥.木本油料西康扁桃资源评价及产业化发展策略 ［J］.中国油脂， 2016， 41（11）： 1-5.

［4］陈元堃， 曾奥， 罗振辉， 等.β-谷甾醇药理作用研究进展 ［J］.广东药科大学学报， 2021， 37（1）： 148-153.

［5］张云焕， 冯亚净， 崔兆蕙， 等.小麦胚芽中植物甾醇提取条件优化的研究 ［J］.粮食与油脂， 2018， 31（5）： 35-38.

［6］蒋琼凤， 袁志辉， 李进， 等.蓼蓝中β-谷甾醇的提取及其抗氧化性研究 ［J］.食品工业科技， 2015， 36（6）： 108-112.

［7］王淑美， 吴明侠， 许闽， 等.地黄中β-谷甾醇的含量测定 ［J］.黑龙江医药， 2001（04）： 255-256.

［8］张海波， 李钦.HPLC-ELSD法测定不同时期玉米须中β-谷甾醇的含量 ［J］.河南大学学报（医学版）， 2006（4）： 53-55.

［9］李英霞， 谷颜杰， 马承严.HPLC同时测定大豆甾醇提取物中β-谷甾醇和豆甾醇的含量 ［J］.中成药， 2008（5）： 751-752.

［10］张志舟， 蔡大川， 郑家概， 等.反相高效液相色谱法测定花生中的β-谷甾醇 ［J］.山东化工， 2017， 46（5）： 80-82.

［11］王岩.豆甾醇、β-谷甾醇及其酯化产物的分析测定 ［D］.扬州大学， 2007.

Establishment of a method forβ-sitosterol determination

in Xikangalmond

ZHU Zidong， LI Renai， LU Zeli， CHENG Xiaoxiao， TIANRongrong

（School of Biomedicine， Beijing City University，Beijing 100094， China）

Abstract：

The phytosterol content in Xikang almond kernels is rich and dominated by β-sitosterol. By exploring the conditions such as wavelength， mobile phase ratio， flow rate and column temperature detected by high-performance liquid chromatography， the content of β-sitosterol in Xikang almond kernel was determined. The optimal conditions for the determination of β-sitosterol content are detection wavelength of 201 nm， mobile phase of 100% methanol， flow rate of 1.0 mL/min and chromatographic column temperature of 40 ℃. The methodological investigation results indicate that the method has a good linear relationship with RSD values of precision repeatability and stability are less than 2.0%， and an average spiked recovery rate is 106.14%. The method is stable and reliable which can be used for the content determination of β-sitosterol in Xikang almond kernel.

Keywords：

Xikang almond; β-sitosterol; high performance liquid chromatography; content determination

（責任编辑：刘艳丽）