黑松露多糖提取及纯化研究进展

纪如倩，覃宛鑫，龚湘涵，李秋然，韩伟

（华东理工大学药学院制药工程与过程化学教育部工程研究中心，上海市新药设计重点实验室，上海 200237）

黑松露（perigord truffle）也称块菌、无娘果，是一种生长于地下的野生食用真菌，其对生长环境的需求极高，对阳光、水分或者土壤的pH极其挑剔。黑松露主要分布在阿尔卑斯山脉及喜马拉雅山脉的一些地区，四川省攀枝花附近亦有分布。黑松露多糖十分昂贵，它与鱼子酱、鹅肝酱在欧美同称为三大珍品。黑松露富含粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、维生素B1、维生素B2、维生素C、维生素PP、多糖等元素，营养价值极高，其中，黑松露多糖作为发挥生物活性的最重要的元素，受到人们的广泛研究，其抗衰老、抗氧化、抗炎症、增强免疫力等生理功效为实验所证实。

1 黑松露多糖的药理作用

黑松露的藻、菌、地衣均可入药，其中多糖是黑松露碳水化合物的主要来源，因此其直接体现着黑松露的营养价值。多项研究表明，黑松露多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多项生理活性，与其他药物相比，其毒副作用较低，水溶性好，因而受到研究者的广泛关注[1]。

1.1 免疫调节作用

科学研究表明，黑松露多糖能够在一定程度上进行免疫调节。赵玲[2]通过体外培养小鼠脾淋巴细胞，发现块菌粗多糖直接促淋巴细胞增殖作用和对LPS 诱导的B淋巴细胞增殖作用都不显著，在多糖浓度为100 μg/mL 时表现出较强的促ConA 诱导的T淋巴细胞增殖作用，这一现象可能与黑松露多糖结构有关；其通过体外培养小鼠腹腔巨噬细胞发现，块菌粗多糖在较低浓度下（50 μg/mL）就能显著提高巨噬细胞吞噬中性红的能力，且当浓度大于100 μg/mL 时能极显著提高吞噬能力，NO 的产量随着块菌多糖浓度的提高而升高。另外，体内实验发现，一定浓度的块菌多糖可以有效增强免疫抑制小鼠吞噬细胞的吞噬能力，进一步论证了黑松露多糖是巨噬细胞的重要靶点。由此得出黑松露多糖可以通过增强T 淋巴细胞的增殖能力和巨噬细胞的吞噬能力来提高机体的免疫力。王海燕等[3]提取黑松露多糖并分离出两个组分TP1和TP2，实验结果表明这两种组分对小鼠巨噬细胞（RAW264.7）没有毒性作用，且都能显著增强小鼠巨噬细胞的中性红吞噬能力，但TP1的作用优于TP2。

1.2 抗氧化作用

多项研究发现，多糖在体内和体外都具有较强的抗氧化活性。国琦[4]等从云南黑松露粗多糖中分离出四种不同分子质量的多糖组分：TSP-1、TSP-2、TSP-3 和TSP-4，其中TSP-4含量最低。实验结果显示这四种多糖组分在一定浓度范围内均具有较强的清除DPPH 自由基、ABTS自由基的能力，并有一定的铁离子螯合能力与还原能力，且这种能力与其浓度成正比，但其清除能力均小于维生素C。魏鑫悦等[5]通过体外抗氧化实验得出黑松露多糖清除DPPH 自由基的能力要强于清除羟自由基的能力，且在浓度为3 mg/mL 时清除DPPH 自由基和羟自由基的效果最为显著，分别为64.29%和52.42%。岳金玫[1]研究发现，块菌多糖清除羟自由基效果最好，可能是分离得到的块菌多糖组分不同所导致。

1.3 降血糖作用

多项研究表示，生物大分子的基本组成单位会影响其高级结构及功能，而大多数具有降血糖功效的多糖都含有葡萄糖、半乳糖，少部分含有半乳糖醛酸、鼠李糖和岩藻糖[6]。魏鑫悦等[5]对黑松露多糖的单糖组成进行分析，发现其主要成分分别是甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖，其中葡萄糖含量仅次于甘露糖；多糖类物质通过调控相关消化酶如α-葡萄糖苷酶、麦芽糖酶等活性，调节肝脏糖代谢中关键酶表达和调控肠道菌群等途径达到降血糖作用[6]。魏鑫悦等[5]的实验还发现，黑松露多糖对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，其通过抑制相关消化酶活性来阻止其将多糖水解为葡萄糖，从而降低机体血糖水平。

1.4 抗肿瘤作用

王小花[7]对块菌子实体及其发酵体系多糖组分对人结直肠癌（HCT-116）细胞株、乳腺癌细胞株（SK.BR-3）、肺癌细胞株（A.549）、肝癌细胞株（HepG2）和人白血病HL-60 细胞的增殖抑制作用分别进行了研究，发现块菌发酵体系多糖的肿瘤细胞抑制作用要强于块菌子实体多糖，且对于肝癌细胞HepG2 增殖的抑制作用最为明显。根据胡慧娟等[8]的研究，多糖对于肿瘤细胞的抑制作用可能是因为多糖通过上调细胞凋亡相关因子p21的表达同时下调细胞周期蛋白DI的表达，或者通过上调细胞凋亡相关因子Bax 蛋白，从而诱导细胞的凋亡，直接抑制肿瘤细胞的增殖。

2 黑松露多糖的提取

黑松露多糖具有抗氧化、抗衰老与降低血脂等多种生理功效，如何提高黑松露多糖得率，降低生产成本，且不破坏生物活性，对惠及人类身体健康具有重要意义。在黑松露多糖提取方面，传统方法面临易造成有效成分损失、耗时长等问题，现代提取技术较传统方法具有提取速率快、收率高、无需加热、环保等特点。

2.1 传统提取方法

2.1.1 水煎煮法

水煎煮法即水提法，是传统工艺提取中最常用的方法。该法是将中药与水煎煮取汁，其一般原理：将预处理粉碎好的中药置于适宜的煎煮器中，向其中加水并浸没中药，先浸泡一段时间后再对其加热至微沸，保持微沸一段时间后，将煎出液分离，回收药渣再进行2～3次煎煮，回收合并各次煎煮液，再对煎煮液进行后续精馏纯化得到最终有效成分。此法实验设备简单，操作工艺简便，周期较短，但该法在煎煮过程中易造成黑松露焦糊，对温度的控制较为严格，此外，由于多糖从细胞中浸取量少，最终产率较低，故此法不适用于对黑松露多糖的直接提取。

2.1.2 水提醇沉法

水提醇沉法是目前较为常用的黑松露多糖传统提取方法，是水煎煮法进一步优化的提取工艺。该法利用多糖类物质易溶于水，难溶于乙醇等有机溶剂的原理对多糖进行提取。水提醇沉法根据浸取剂pH 的不同，可分为水提法、酸提法、碱提法。

水提法又可分为热水浸提与冷水浸提，而对于多糖通常采用热水浸提的方法。用热水将多糖进行萃取，由于多糖不溶于乙醇，可通过沉淀将多糖提取出来。岳金玫等[1]在单因素试验的基础上，测得传统热水浸提法的最佳工艺参数为提取温度90℃，提取时间60 min，料液比33∶1（g/mL），在该条件下多糖理论提取率为13.45%，理论含量为70.75%，并验证得实际提取率为13.32%，实际含量为71.55%。该方法较一些其他传统提取方法最终提取率较高，但该法由于实验所需温度高、耗能多、耗时长，现在很少单独使用此方法进行提取。

酸碱提取法通过破坏多糖与其他物质结合的化学键，使多糖变为游离态后再进行提取，在实验过程中由于使用酸碱浸提剂的原因，易造成环境污染。此外，不同黑松露多糖嗜酸碱性不同，实验前应对不同黑松露多糖结构进行鉴定。故因其实验时间较长，工作量较大，目前很少用于多糖的提取。

2.1.3 渗漉法

渗漉法是一种动态的传统提取方法，具体操作步骤：将原药材进行粉碎等处理后置于渗漉筒中，从筒的上部不断添加溶剂，溶剂通过装置往下流，并不断渗过药材，此时有效成分将随之浸出。实验前选用合适的溶剂，将黑松露多糖提取出，此法溶剂的利用率高，有效成分能最大程度地浸出。渗漉法适用于一些贵重药材的提取，对于黑松露多糖的提取而言无疑是有益的，但其易造成渗漉筒堵塞，导致产出率降低，故在多糖的提取中鲜用此法。

2.2 现代提取方法

2.2.1 超声波辅助法

超声波辅助法是利用20～50 kHz的机械波，产生强烈的空化效应、机械振动、扰动效应、击碎和搅拌等多种作用而实现的。当大量的超声波作用于提取物时，空穴效应使液体微粒间发生猛烈的撞击作用，从而达到破坏细胞壁、加速目标产品进入溶剂的效果。天然产物样品的前处理工作繁重、操作繁琐、耗时长，超声提取技术可以防止多糖降解和多糖活性的降低，而且能缩短提取时间，减小料液比，提高提取效率，降低生产成本[9]。

超声波处理时间、处理温度、处理功率等均会对最终产率造成影响，故其常搭配正交试验、Box-benhnken Design优化、响应面优化法等对其各影响因素进行最优化处理。岳金玫等[1]运用Box-benhnken Design 优化超声辅助提取黑松露多糖，发现最佳提取工艺为超声时间36 min，超声温度50℃，液料比为40∶1（g/mL），超声功率为140 W，在此条件下多糖得率为18.15%。黄治国等[10]运用正交试验优化超声辅助提取黑松露多糖，发现最佳提取工艺为料液比l∶30（g/mL），超声波温度40℃，超声波功率100 W，超声波处理60 min，在此条件下黑松露多糖提取率为17.86%。

2.2.2 复合酶法

不同种类的酶作用靶点不同，因此使用复合酶比单一酶更高效[11]。大多情况下植物多糖被包裹在细胞壁内，纤维素酶能破坏细胞壁，使多糖从细胞中释放出来；而蛋白酶可以水解糖缀合物中的蛋白质，有利于多糖的浸出。酶法相对于超声波或微波更为温和，对多糖结构的破坏较少，并且其对设备和工艺的要求也较低，更适用于大规模生产[12]。

清源等[12]利用纤维素酶和中性蛋白酶对黑松露多糖进行提取，发现黑松露多糖的最佳提取工艺条件为酶配比1∶7（g/g），酶解时间48 min，酶解温度41℃，酶用量3.6%，酶解pH 值4.8，料液比1∶29（g/mL），此条件下黑松露多糖的得率可达14.50%，说明复合酶法可用于黑松露多糖的提取。

2.2.3 微波辅助法

微波辅助提取技术是利用微波能，使得细胞内分子吸收微波产生大量热能，导致胞内的温度上升，加剧热运动，同时液体汽化产生的压力可导致细胞壁破裂，胞内物质渗出；同时胞内液体汽化发生减少，细胞壁破裂，萃取液进入胞内，溶解并释放胞内物质。该方法中微波能量利用率高，温度提升快，加热均匀，浸取时间短[13]。

清源[14]利用微波法提取黑松露多糖，发现最佳提取条件为微波功率320 W，料液比1∶40（g/mL），微波时间200 min，此条件下多糖提取率为15.54%，表明微波辅助法应用于黑松露多糖提取是可行性的。

3 黑松露多糖的纯化

目前，纯化黑松露多糖的常用方法有水提醇沉法、树脂吸附法以及吸附澄清法，这些方法在实际应用过程中往往有提取率较低或杂质较多等弊端。近年来一些新兴的膜分离技术能够集分离、精制、浓缩为一体，为分离纯化提供了帮助[15]。

3.1 传统纯化方法

3.1.1 大孔吸附树脂法

大孔树脂吸附技术是多糖类纯化的常用技术，可根据纯化物质的特点选择不同型号的树脂，树脂本身不含有离子，其因分子间作用力而有吸附性。该法基本程序简单：将树脂置于层析柱中，以粗多糖溶液上样，用乙醇洗脱后回收，得到多糖溶液[16]。文献搜索中缺少其应用于黑松露的实例，而基于树脂吸附成本较低、纯化效果好、广泛用于天然产物纯化的特点，可在粗提取后的富集步骤中使用，且粗处理后的多糖多酚含量仅存0.49%[4]，大大降低了脱色处理的难度。该方法的缺点是预处理难度较大，使用过程中易破碎。

3.1.2 凝胶柱层析法

凝胶柱层析又称分子筛层析，可根据多糖的形状与分子量大小将其分离，常以聚糖为固定相，无机盐溶液为洗脱液，待洗脱液平衡[17]，再加入样品，物质按分子量从大到小的顺序出柱，得到分子量均匀的小分子多糖[18]。王海燕等[3]将用蒸馏水洗脱的、经阴离子交换层析的黑松露多糖干品命名为TP1，其在葡聚糖凝胶柱层析后多糖含量高达91.51%，且该分子量多糖之前未见报道，突出该方法纯化能力和效率较高的特点。虽然可通过选择不同长度的层析柱进行分辨率的调整，但不适宜在分离黏多糖或样品量多的情况下使用[19]。

3.1.3 季铵盐沉淀法

长链季铵盐作为阳离子清洁剂或碱性表面活性剂，可与溶于水中的酸性多糖的阴离子结合，将其沉淀分离[20]。将粗多糖配制成pH 适宜的溶液，加入季铵盐溶液，收集离心或静置沉降后产生的沉淀，经反复溶解与沉淀后用乙醇多次洗涤，可得到较纯净的多糖产物[2]。正负电荷的结合使该方法局限于酸性多糖的纯化，且溶液中带负电的蛋白质会产生影响，导致纯化效果不理想[20]。国琦等[4]证明，多糖经过前处理，蛋白质基本除去，他们同时应用了Sevag法和透析法，最终蛋白质含量仅为2.23%，成为可应用于黑松露纯化的有力证据。

3.2 新型纯化方法

3.2.1 微滤法

微滤即为microfiltration。微孔滤膜的物理结构起主要作用，可将小分子与少数大分子透过，而把漂浮颗粒物、细菌和病毒等截留在膜外[21]，既能单独使用，也能作为与其他膜技术连用的第一步。该技术的原理是筛分，推动力则是压力差，全量过滤即将滤膜置于溶液的下方，但经过一定的时间后膜通量下降，需更换或清洗膜表面。交叉流过滤进一步发展，溶液平行流动，减少了污染层，使过滤速度保持在较高的水平。黑松露作为一种食用菌，其提取液中常含有木质素、菌丝等小微米级的固体悬浮物以及尚未除去的某些蛋白质，利用该方法可以有效除去这些杂质而不会造成多糖含量的损失，可有效提高多糖的产率。

3.2.2 超滤法

粗提液流经超滤膜表面，以分子量截留值为界，分子量较小的溶质通过此膜，称为透过液，其余部分则为截留液，这个方法便是超滤法[22]。超滤膜是非对称性孔膜，分为活化层和多空层，优秀的筛分作用较醇沉法而言，能更好地保留所需成分，加之操作简便、条件温和，一度成为研究热点并加以广泛应用。影响超滤效率的因素较多，如温度、压力、pH等[23]，应用在多糖纯化中，常通过正交实验确定最优条件。魏鑫悦在对攀枝花黑松露多糖的研究中测得黑松露多糖的分子量为1.29×104[5]，可选择适当大小的超滤膜对其截留而更好地保留有效成分。

3.2.3 无机陶瓷膜法

无机陶瓷膜作为无机材料，主要除去一些大分子物质，拥有耐高温、性质稳定、可反复清洗使用等聚合分离膜所没有的优点。实验过程中通常使用无机陶瓷膜设备，以压力驱动错流过滤，截留液随循环浓度不断增大，具有纯化的作用[24]。与此同时，膜的通量也不断下降，甚至会对产品的收率有所影响，可采用不同的清洗方法使其更快地恢复，延长使用寿命。该方法是对黑松露等蕈类菌种纯化较为先进的方法，具有提纯产率高的特点。

3.2.4 磁性复合膜法

Fe3O4-PSF 是一种受外加磁场影响后，可改变膜孔径的新型磁性复合膜[25]，相对于分子量截留值不变的膜来说，能够连续分离分子量不同的物质。实验过程中，改变磁场强度，调整截留分子质量，可获得不同的透过液，实现多糖的分级纯化[26]。由于制备该磁性复合膜时会出现一定差异，使用前应先测定不同强度下的截留率，避免滤过速度过慢或因磁场强度过大导致膜破损。在黑松露单糖组成的分析中，该方法具有广阔的应用前景。

4 展望

黑松露多糖作为黑松露发挥作用的主要成分，其生理功效毋庸置疑，但因黑松露本身生长条件苛刻、价格昂贵，加之实验操作困难，目前系统性的提取纯化工艺尚未形成，这对相关药物开发及中成药的研制造成了一定阻碍。

对于一种生物类药物或食品的研究，一些常用的多糖提取方法，如利用水或乙醇等有机试剂提取可以对其起到分离纯化的作用，但对于黑松露这种昂贵且极其珍贵的物种，一些极大地提高其提纯率的新型提取方法亟待深入研究。随着科技不断发展，越来越多新型方法在设备更新换代的基础上不断涌现，为提取纯化工艺提供了新的思路与方向。在今后的研究中，一条完整的、最优的黑松露多糖提取工艺亟待构建，并将规模化应用于黑松露多糖的工业生产之中。