基于网络药理学研究红景天苷治疗新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的作用机制

陈茹佳,刘建霞,闵加威

新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是指因围产期新生儿脑部血流量减少、宫内窘迫、脐带绕颈等引起的脑组织缺氧缺血性损伤,主要表现有新生儿意识、肌张力改变及原始反射异常,可能引起新生儿死亡和智力低下、癫痫、脑瘫等近远期后遗症[1],给患儿家庭及社会带来沉重负担。目前,临床上治疗HIBD的主要方法有纠正酸中毒、吸氧和亚低温治疗等[2],但这些方法并不能有效修复受损神经细胞,在改善患儿远期预后方面效果不显著,故需要开发新的预防或协同治疗手段。红景天苷是中药蔷薇科草本植物红景天的主要有效成分,本质是苯丙烷类糖苷化合物(C14H20O7),安全性高且药理作用广泛。研究表明,红景天苷通过抑制细胞凋亡、氧化应激和炎症反应等途径发挥抗缺氧、抗氧化、抗炎症、抗衰老、神经保护等多种药理作用[3-8],然而红景天苷在新生儿HIBD中的作用机制尚不明确。网络药理学作为一种系统性的医药研究新模式,能够有效建立药物活性成分与疾病作用靶点之间的内在联系[9],现已被广泛应用于探索单一成分或中医药制剂发挥药效的途径方式[10]。基于此,本研究拟利用网络药理学方法,探讨红景天苷治疗HIBD的可能机制,解析关键作用靶点和信号通路,并通过体内实验验证红景天苷治疗新生小鼠HIBD的实际效果,为临床深入研究红景天苷治疗新生儿HIBD提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料及仪器

1)实验动物:C57BL/6小鼠购自湖北省实验动物研究中心[SCXK(鄂)2020-0018],饲养于中南民族大学动物实验中心,环境温度18～22 ℃,相对湿度50%～60%,12 h循环照明,饲养密度为每10只小鼠0.09～0.63 m2。

2)药物与试剂:红景天苷购自MCE公司;HE染液套装(G1003)、Bax抗体(2772)、Bcl-2抗体(3498)、Cleaved-caspase-3抗体(9661)购自Cell Signaling Technology(美国)。

3)主要仪器:小动物麻醉机(R500IE);全自动常压持续性缺氧(富氧)装置(XBS-03);大小鼠抓力测定仪(YLS-13A);化学发光成像系统(C280)。

1.2 网络药理学分析

1)药物靶点筛选:从PubChem数据库搜索并下载红景天苷2D结构的SDF文件和SMILES结构式。将SMILES结构式输入Similarity Ensemble Approach(SEA)数据库筛选出药物相关靶点。使用SDF文件搜索Swiss Target Prediction数据库和Pharm Mapper数据库,设置种属为“Homo sapiens”进行靶点筛选。

2)疾病靶点筛选:使用DisGeNET数据库、GeneCards数据库和OMIM数据库分别以“neonatal hypoxia ischemia brain damage”“neonatal hypoxia ischemia encephalopathy”“neonatal hypoxic ischemic encephalopthy”为关键词进行检索,将获得的相关靶点基因合并后删除重复得到疾病相关靶点。

3)“药物-疾病”交集靶点筛选:对所有收集到的靶点进行Uniprot ID转换,统一转换为“Gene name”。将红景天苷作用靶点和疾病相关靶点导入Venny 2.1在线软件做图工具平台,绘制韦恩图,二者取交集后获得红景天苷-HIBD交集靶点。

4)潜在靶点蛋白质相互作用(PPI)网络构建:将红景天苷-HIBD共同靶点上传STRING数据库,将生物种类设定为“Homo Sapiens”,最小互相作用阈值设定为0.4,隐藏不相连蛋白,其余设置为默认,构建PPI网络。将PPI网络导入Cytoscape软件,通过“Network Analyzer”得出相互作用网络的拓扑学参数,degree排序后,选取degree前10位基因作为核心靶点。

5)GO功能和KEGG通路富集分析:将红景天苷-HIBD潜在作用靶点导入DAVID数据库,利用GraphPad Prism软件,分别从生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)层面进行GO功能富集分析。同时,将潜在作用靶点导入DAVID数据库,利用微生信在线工具,通过选取前20位通路形成KEGG通路富集分析条形图,进而找出红景天苷-HIBD作用关键通路。

1.3 实验验证

1)模型制备:选取鼠龄10 d、平均体质量5 g的小鼠,基于Rice Vannucci方法[11]建立HIBD模型。用4%异氟烷麻醉小鼠,固定并结扎右侧颈总动脉,缝合伤口后回笼恢复。2 h后,将小鼠置于37 ℃、含10%氧气和90%氮气的恒温缺氧箱中缺氧1 h。模型制备完成后,由尾部提起小鼠,当观察到小鼠头部产生单侧偏转现象,判断模型制备成功。

2)实验分组:将小鼠随机分为假手术组(n=21)、缺氧缺血组(n=21)、安慰剂组(n=21)和红景天苷组(n=21)。其中,假手术组仅进行麻醉、在切开暴露右侧颈总动脉后直接缝合伤口;缺氧缺血组完成整个模型制备过程;基于文献调研结果[12-13]和实验室前期工作,造模后,红景天苷组按100 mg/kg用二甲基亚砜(DMSO)稀释红景天苷后腹部注射给药1次;安慰剂组不给药,只腹部注射按100 mg/kg用DMSO稀释的生理盐水。

3)TTC染色:造模后24 h,将小鼠过量麻醉处死,剪刀断头,剖开颈部皮肤,剪开脑膜,去掉嗅球小脑,取出各实验组小鼠完整脑组织(n=6),冷冻切片,厚度1～2 mm。配制2%TTC染液,浸没切片,37 ℃避光孵育10～15 min。孵育完成后,回收染液,滴加4%多聚甲醛至完全覆盖切片,在4 ℃下固定过夜。使用扫描仪观察摄片,使用Image-Pro Plus 6.0软件定量分析梗死区域。

4)HE染色:造模后24 h,将小鼠过量麻醉处死,剪刀断头,剖开颈部皮肤,剪开脑膜,去掉嗅球小脑,取出各实验组小鼠完整脑组织(n=3),制备石蜡切片进行HE染色。脱蜡后,使用苏木素染液染色3～5 min,分化返蓝后流水冲洗。梯度乙醇脱水后,使用伊红染液染色5 min,再次脱水后用中性树胶封片。染色结束后,细胞核呈蓝色,细胞质呈红色。使用尼康DS-U3相机×20物镜在顶叶皮层、海马CA1区域采集图像。

5)Western blot:造模后24 h,将小鼠过量麻醉处死,剪刀断头,剖开颈部皮肤,剪开脑膜,去掉嗅球小脑,收集各实验组小鼠脑损伤侧脑组织(n=6),加入裂解液,获取裂解液混合物。4 ℃下15 000 r/min离心15 min,获得上清。将上清与5×loading buffer按4︰1混合煮沸,获得所需样品。采用雅酶快速配胶试剂盒配制电泳凝胶,跑电泳转膜后,获得目的条带,并用一抗、二抗孵育。利用化学发光成像系统进行显影,使用Quantity One 4.6.1软件对获取的蛋白印记进行分析。

6)运动神经行为评估:在造模后21 d开展行为学测试,各实验组小鼠(n=6)按照顺序完成Y迷宫实验[14-16]、拉力测试[17]和角落实验[18],不提前训练小鼠以便获得客观数据。a.Y迷宫实验:Y迷宫由3个不透明手臂呈120°布置,测试时将小鼠放置于迷宫任意一臂末端,并允许其探索任意一个手臂,实验时间8 min。观察小鼠进入各臂顺序,记录总进臂次数(小鼠4只脚均进入迷宫臂记为1次)和自发交替次数(依次连续进入全部3个手臂记为1次),计算自发交替行为概率。自发交替行为概率=自发交替次数/(总进臂次数-2)×100%。b.拉力测试:实验采用YLS13A拉力系统测量小鼠脑损伤对侧前肢力量,每只小鼠实验3次,取平均值进行分析,以便评估小鼠运动能力。c.角落实验:实验在2块纸板形成的30°角落中开展,通过观察小鼠的活动轨迹,记录小鼠在20次实验中右转的次数,以便评估小鼠记忆能力。右转率=(右转次数/20)×100%,以右侧胡须接触角落壁记为小鼠右转。

7)脑萎缩量化:小鼠完成行为学测试后,取脑组织,采用高精度天平(精确值:0.000 1 g)分别对损伤对侧和同侧脑组织进行称重。脑组织损失百分比=损伤同侧半脑重量/损伤对侧半脑重量×100%[19]。

1.4 统计学方法

以上所有实验每组至少进行3次,操作人员严格遵守双盲实验流程。应用GraphPad Prism 8.0软件处理数据,采用t检验或单因素方差分析,使用Tukey/邓肯检验进行2组以上分析。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 靶点搜索结果

1)药物靶点搜索结果:搜索Swiss Target Prediction、SEA和pharm Mapper数据库,共获得靶点182个,删除重复项,最终获得有效药物靶点176个。

2)疾病靶点搜索结果:搜索Gene Cards、OMIM和DisGeNET数据库,共获得靶点2 980个,删除重复项,最终获得有效疾病靶点2 173个。

2.2 交集靶点Venn图

综合药物靶点和疾病靶点结果,利用Venny2.1绘制“药物-疾病”靶点交集Venn图(图1),得到交集靶点61个。

图1 红景天苷治疗缺氧缺血性脑损伤小鼠实验交集靶点Venn图

2.3 潜在靶点PPI网络图

采用STRING数据库和Cytoscape 3. 9. 1软件构建潜在靶点PPI网络,删除无相互作用的靶点后剩余有效靶点59个,见图2。通过拓扑网络分析筛选出前10位核心靶点,构建核心靶点PPI网络图(图3)。分析显示,Akt1、IL6、EGFR、HSP90AA1、ESR1、PPARG、SRC、FGF2、KDR、IL2可能为红景天苷治疗HIBD的重要靶点。

PPI为蛋白质相互作用。

PPI为蛋白质相互作用。

2.4 GO功能富集分析结果

GO功能富集结果前10个条目见图4。BP主要富集到信号传导、细胞增殖的正调控、凋亡过程的负调控;CC主要富集到细胞溶质、细胞膜、胞外区域;MF主要富集到蛋白质结合、ATP结合、相同蛋白质结合。

图4 红景天苷治疗缺氧缺血性脑损伤小鼠实验潜在靶点GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析结果

KEGG通路富集分析显著性居前20位的信号通路气泡图见图5。KEGG通路富集分析结果表明,PI3K-Akt、Rap1、Estrogen等信号通路与红景天苷-HIBD潜在靶点作用机制紧密联系。

图5 红景天苷治疗缺氧缺血性脑损伤小鼠实验潜在靶点KEGG通路富集分析

2.6 红景天苷对新生小鼠HIBD诱导脑梗死体积的影响

TTC染色结果示:假手术组小鼠脑组织完整,未见脑梗死区域;缺氧缺血组和安慰剂组小鼠脑组织出现明显白色梗死区域;红景天苷组小鼠脑组织梗死区域相比缺氧缺血组和安慰剂组明显减小。使用Image-Pro Plus 6.0软件进行定量分析,结果见图6。与缺氧缺血组和安慰剂组相比,红景天苷组脑梗死体积显著缩小(P<0.01),提示红景天苷治疗可有效缓解HIBD诱导的脑梗死。

HIBD为缺氧缺血性脑损伤;与红景天苷组比较,①P<0.01。

2.7 红景天苷对新生小鼠HIBD诱导的顶叶皮层神经元和海马神经元损伤的影响

HE染色结果见图7,假手术组的顶叶皮层神经元形态完整、排列整齐,层次清晰、形态及数量正常,染色均匀;海马CA1区神经元排列整齐,可见清晰的海马结构形态;缺氧缺血组和安慰剂组出现大量空泡,神经元结构萎缩、分布紊乱、排列松散,细胞胞质空泡化,细胞核固缩;红景天苷组神经元的形态、结构、排列得到明显改善,空泡减少。结果显示,红景天苷治疗逆转了新生小鼠HIBD后脑损伤同侧顶叶皮层和海马CA1区神经元形态损伤。

HIBD为缺氧缺血性脑损伤。

2.8 红景天苷可激活PI3K/Akt信号通路、减少新生小鼠HIBD诱导的细胞凋亡

Western blot结果及统计分析见图8。从蛋白条带看(图8a),红景天苷组p-PI3K和p-Akt表达量相较缺氧缺血组和安慰剂组明显增多,PI3K和Akt表达量明显减少。从统计结果看(图8b、8c),与缺氧缺血组和安慰剂组相比,红景天苷组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量显著增加(P<0.05、P<0.01),说明红景天苷促进了PI3K和Akt的磷酸化,提升了磷酸化的PI3K和Akt占比,激活了PI3K/Akt信号通路。从蛋白条带看,红景天苷组抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平较缺氧缺血组和安慰剂组均有升高;红景天苷组促凋亡蛋白Bax表达水平较假手术组变化不大,但缺氧缺血组和安慰剂组Bax表达水平相较假手术组明显升高。为衡量Bcl-2和Bax表达的综合作用,分析二者的相对含量(图8d),红景天苷组Bcl-2/Bax表达水平较假手术组、缺氧缺血组和安慰剂组均显著升高(P<0.01),说明红景天苷治疗使小鼠体内抗凋亡蛋白相较促凋亡蛋白表达更有力。此外,从统计结果看(图8e),缺氧缺血组和安慰剂组促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表达水平相较假手术组升高明显;红景天苷组Cleaved-caspase-3表达水平相较假手术组升高不明显。这些结果表明,红景天苷可以激活PI3K/Akt信号通路、减少新生小鼠HIBD诱导的细胞凋亡。

HIBD为缺氧缺血性脑损伤;8a.Western blot检测各组新生小鼠PI3K/Akt信号通路相关蛋白和凋亡相关蛋白表达图;8b～8e.各蛋白表达水平的定量分析;与假手术组比较,①P<0.01;与红景天苷组比较,②P<0.05,③P<0.01。

2.9 红景天苷对新生小鼠HIBD诱导的长期神经功能和脑萎缩的影响

Y迷宫实验结果见图9a,与假手术组相比,缺氧缺血组和安慰剂组小鼠表现较低的自发交替率;而与缺氧缺血组和安慰剂组相比,红景天苷组自发交替成功的比率明显提高(P<0.01)。拉力测试结果见图9b,与假手术组相比,缺氧缺血组和安慰剂组损伤侧对侧前肢拉力明显降低;而与缺氧缺血组和安慰剂组相比,红景天苷组小鼠损伤侧对侧前肢拉力显著增强(P<0.01)。角落实验结果见图9c,与假手术组相比,缺氧缺血组和安慰剂组小鼠明显更倾向于右转;而与缺氧缺血组相比,红景天苷组小鼠右转率明显降低(P<0.01)。假手术组小鼠的脑组织形态结构完好,而缺氧缺血组和安慰剂组小鼠均出现了不同程度的脑萎缩和脑组织丢失;红景天苷治疗后,脑萎缩情况得到改善。小鼠损伤同侧和对侧大脑半球的质量比分析见图9d,与缺氧缺血组和安慰剂组相比,假手术组右脑出现了脑组织缺损;与缺氧缺血组相比,红景天苷组提高了损伤同侧和对侧半球的质量比(P<0.01),改善了右脑的组织丢失情况。

HIBD为缺氧缺血性脑损伤;9a～9c为使用Y迷宫实验、拉力测试、角落实验评估各组新生小鼠的神经功能;9d采用损伤同侧与对侧半球的脑重量比评估脑组织丢失程度;与假手术组比较,①P<0.01;与红景天苷组比较,②P<0.01。

3 讨论

新生儿HIBD多是由围产期窒息所引发的新生儿脑损伤疾病,随着现代医疗技术的发展,HIBD的神经保护策略、神经康复技术及相关基础研究均取得了较大进步,但目前针对HIBD尚无确切有效的治疗方法。既往研究表明,红景天苷有多种丰富的药理作用,已被证实其可通过多个信号通路发挥脑缺血性神经损伤保护作用[20-23],但其对新生儿HIBD的保护机制尚未见报道。为明确红景天苷对HIBD作用的相关分子机制,本研究通过网络药理学方法探索红景天苷治疗新生儿HIBD的可能机制,并在此基础上进行实验验证。

网络药理学分析结果表明,红景天苷作用于HIBD的核心靶点包括Akt1、EGFR和IL6等。GO功能和KEGG通路富集分析显示,红景天苷治疗HIBD涉及多种生物过程和多个信号通路,主要在调控细胞增殖、抑制细胞凋亡等过程中发挥作用,相关性较高的信号通路包括PI3K/Akt、Rap1和Estrogen等,其中PI3K/Akt通路富集基因较多,同时Akt1是PPI网络中的显著靶点,提示红景天苷可能通过PI3K/Akt通路治疗HIBD。

研究表明,PI3K/Akt信号通路是参与调控细胞分化、增殖和凋亡等功能的重要信号通路,可以通过激活PI3K/Akt信号通路,发挥相关神经保护作用[24-28]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,PI3K激活后可磷酸化细胞膜表面的二磷酸磷脂肌醇,形成三磷酸磷脂肌醇(PIP3),PIP3通过与Akt的PH结构域结合,促使Akt从细胞质转位到细胞膜并引发构象改变,进而磷酸化Akt的苏氨酸和丝氨酸位点使Akt完全活化[29]。Akt作为细胞凋亡的强效抑制因子,对细胞凋亡起着重要调控作用。Akt1是Akt的3种亚型之一,能够介导调整新陈代谢、细胞存活和血管生成等诸多生物学过程[30-31]。活化的Akt进一步磷酸化Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3等下游蛋白,从而介导细胞生长、增殖及细胞周期和糖代谢的调控[32]。在新生儿HIBD发病过程中,细胞凋亡起着重要作用[33]。Bcl-2是重要的细胞凋亡抑制基因,而Bax具有促进细胞凋亡作用,Cleaved-caspase-3是凋亡过程主要执行者,在细胞凋亡中发挥关键性作用[34-35]。红景天苷通过抑制细胞凋亡内源性途径发挥HIBD保护作用[36],它能够借助上调抗凋亡因子Bcl-2或下调促凋亡因子Bax表达[37],抑制Cytochrome C从线粒体向细胞质释放,进而下调Cleaved-caspase-3表达,抑制细胞凋亡。PI3K/Akt信号通路和相关蛋白在治疗HIBD过程中起重要作用,LI等[38]和阳梅等[39]也分别借助刺囊酸和芍药内酯苷做出了探索性工作。

本研究验证了红景天苷在调节HIBD小鼠脑组织凋亡方面的作用,Western blot实验结果显示,红景天苷可上调HIBD新生小鼠脑组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的蛋白表达,降低促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表达,同时上调抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达,提升Bcl-2/Bax相对表达水平,使得小鼠体内抗凋亡蛋白较促凋亡蛋白表达更明显。实验进一步表明,红景天苷治疗可明显减轻HIBD新生小鼠脑损伤程度,降低脑梗死率,显著改善小鼠脑损伤,提高小鼠的记忆和运动能力,有助于小鼠运动神经功能障碍和脑萎缩的长期恢复。

综上,红景天苷通过激活PI3K/Akt信号通路抑制神经元凋亡,进而对新生小鼠HIBD提供神经保护。本研究提示红景天苷是治疗新生儿HIBD的潜在化合物,为临床药物的研发提供了实验证据和理论依据。

伦理学声明：本研究遵照了科学可行的实验方案,并通过了中南民族大学伦理委员会审查批准(2024-scuec-050),符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：文章的全部作者声明,在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

作者贡献声明：1)闵加威负责设计论文框架,负责拟定写作思路,指导撰写文章并最后定稿;2)陈茹佳负责实验操作,研究过程的实施,实验数据收集,统计学分析和图示绘制,起草并修改论文;3)刘建霞负责药物和疾病的网络药理学分析,网络药理学相关方法,图示和结果编写和修改。