金水六君煎物质基准中半夏和陈皮的薄层鉴别研究
2024-05-30王欣董自亮李红亮吴瑞军覃瑶彭涛秦少容罗维早
王欣 董自亮 李红亮 吴瑞军 覃瑶 彭涛 秦少容 罗维早
【摘 要】目的：建立经典名方金水六君煎物质基准中半夏和陈皮的薄层鉴别方法。方法：以半夏对照药材为对照，对金水六君煎中半夏进行薄层鉴别研究，以橙皮苷和陈皮对照药材为对照，对金水六君煎中陈皮进行薄层鉴别研究，并对其进行方法学验证。结果：建立的薄层色谱法能鉴别出半夏和陈皮，斑点对应较好，阴性无干扰，方法学考察结果显示，方法适应性良好。结论：本法简单可行、结果可靠、重复性好，可作为金水六君煎物质基准的质量控制方法。
【关键词】金水六君煎；半夏；陈皮；橙皮苷；薄层色谱
【中图分类号】
R284.1 【文獻标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）06-0047-06
DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.06.zgmzmjyyzz202406011
Study on the Thin Layer Identification of Pinelliae Rhizoma and Citri Reticulatae
Pericarpium in the Material Reference of Jinshui Liujun Decoction
WANG Xin1，2DONG Ziliang1，3LI Hongliang3WU Ruijun2QIN Yao2PENG Tao3QIN Shaorong2LUO Weizao1，2*
1.Chongqing Institute of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China;
2.Taiji Group Co.，Ltd.，Chongqing 401147，China;
3.Taiji Group Chongqingfulin Pharmaceutical Co.，LTD.，Chongqing 400800，China
Abstract：Objective Establishing the TLC identification methods of Pinelliae Rhizoma and Citri Reticulatae Pericarpium in the material reference of classical Jinshui Liujun Decoction （JLD）.Methods The TLC method for the identification of Pinelliae Rhizoma in JLD was established by using Pinelliae Rhizoma as the reference drug;A TLC method was established for the identification of Citri Reticulatae Pericarpium in JLD with hesperidin and Citri Reticulatae Pericarpium as the control，the methods were verified.Results The established thin-layer chromatography method can identify Pinelliae Rhizoma and Citri Reticulatae Pericarpium，and have the advantages of better spots on TLC with the same color，no interference in negative control.The results of the methodological investigation showed that the method had good adaptability.Conclusion The methods are simple and feasible，with high reproducibility，can be used as a quality control method of the material reference of JLD.
Key words：Jinshui Liujun Decoction（JLD）;Pinelliae Rhizoma;Citri Reticulatae Pericarpium;Hesperidin;Thin-layer Chromatography （TLC）
金水六君煎出自明代张景岳的《景岳全书》，为“新方八阵·和阵”首剂。全方由当归、熟地、陈皮、半夏、茯苓、炙甘草和生姜七味药组成，具有润枯燥湿、益阴化痰的功效，主治肺肾虚寒、水泛为痰、或年迈阴虚、血气不足、外受风寒、咳嗽呕恶、喘逆多痰［1-2］。
经典名方物质基准，是指以古代医籍中记载的经典名方制备方法为依据制备中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应与古代医籍记载基本一致［3-4］。经典名方物质基准是连接经典名方传统制法与现代生产工艺的中间过渡对照物［5］。建立和完善金水六君煎物质基准的质量标准，可为金水六君煎复方制剂的质量评价提供技术支撑。
近年来，国内外对金水六君煎的化学成分、药理活性和临床应用研究广泛，但对质量标准的报道较少。目前，有文献报道了金水六君煎及其物质基准中熟地、炙甘草和生姜的薄层鉴别方法学［6-7］，尚未见金水六君煎物质基准中半夏和陈皮的系统薄层鉴别方法学研究。现有关于金水六君煎中半夏和陈皮的薄层鉴别方法，存在薄层样品中干扰杂质多、展开剂有剧毒物质苯、薄层展开效果欠佳等问题。
为此，文章建立金水六君煎物质基准中半夏和陈皮的薄层鉴别方法，
以期为金水六君煎的开发和质量控制提供参考依据。
1 材料
1.1 仪器 AE240万分之一电子天平；XSE205十万分之一电子天平；KQ-500DE数控超声波清洗器；CAMAG薄层色谱扫描仪。
1.2 试剂 石油醚（60～90 ℃）（20190301）、环己烷（20190601）、甲苯（20200301）、三氯甲烷（20180501）、乙酸乙酯（20190901、20191001）、丙酮（20150820）、无水乙醇（20200101）、甲醇（20200101）、甲酸（201801101），由重庆川东化工（集团）有限公司提供，均为分析纯；水为重蒸水。
1.3 耗材 金水六君煎物质基准样品（批号：JS001～JS020）、缺半夏阴性物质基准样品、缺陈皮阴性物质基准样品，均由太极集团涪陵制药厂提供。半夏对照药材（121272-201806）、陈皮对照药材（120969-201510）、橙皮苷（110721-201617）购自中国食品药品检定研究院。硅胶薄层板购自青岛谱科分离材料有限公司和海浪硅胶干燥剂有限公司。
2 方法与结果
2.1 金水六君煎物质基准的制备 根据国家中医药管理局联合国家药品监督管理局发布的《古代经典名方关键信息表（25首方剂）》，取熟地黄14.92 g、陈皮5.60 g、炒甘草3.73 g、当归、茯苓、清半夏各7.46 g、生姜5.00 g，加水400 mL，煎煮至140～160 mL。结合课题组前期预试验，按处方量称取药材，置于陶瓷锅中，加水400 mL，浸泡30 min，武火加热至沸腾，文火继续加热约60 min，趁热滤过，滤液放凉，冷冻干燥，得物质基准冻干粉。
2.2 半夏的薄层鉴别
2.2.1 溶液的制备 供试品溶液：取金水六君煎物质基准粉末10.0 g（批号：JS001），加乙酸乙酯超声提取2次（50 mL、25 mL），每次超声时间 30 min，滤过，合并乙酸乙酯液，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解。
半夏对照药材溶液：取半夏对照药材1.0 g，加乙酸乙酯25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解。
阴性溶液：按照金水六君煎配方称取除半夏外的其他药材，按照“2.1”项下金水六君煎物质基准制备方法，制成缺半夏阴性物质基准。取缺半夏阴性物质基准适量，按“2.2.1”项供试品溶液制备方法，制成缺半夏阴性溶液。
2.2.2 薄层色谱条件 照薄层色谱法［8］试验，吸取“2.2.1”项下供试品溶液和缺半夏阴性溶液各10 μL，半夏对照药材溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（30∶6∶4∶0.5）为展开剂，预饱和20 min，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的主斑点；阴性对照溶液在与对照药材色谱相应的位置上，无相同颜色的斑点（图1）。
1.半夏供试品溶液；2.半夏对照药
材溶液；3.缺半夏阴性溶液
2.2.3 薄层板的考察 取硅胶G薄层板，分别按“2.2.2 薄层色谱条件”试验，两种薄层板的薄层色谱信息基本一致（图2），选定青岛谱科的硅胶G薄层板。
2.2.4 供试品溶液点样量考察 供试品溶液的点样量分别为2 μL、6 μL、10 μL、14 μL，按“2.2.2 薄层色谱条件”试验（图3）。综合考虑，供试品溶液点样量为10 μL。
2.2.5 展开环境的耐用性考察 不同温度的比较：分别在4 ℃、25 ℃和40 ℃，预饱和20 min，展开，其余条件同“2.2.2 薄层色谱条件”。结果表明，温度在4～40 ℃范围内，对薄层鉴别无明显影响（图4）。
不同湿度的比较：在室温25 ℃，分别在相对湿度75.3%、43.2%和18.0%预饱和20 min，展开，其余条件同“2.2.2 薄层色谱条件”。结果表明，相对湿度在18.0%～75.3%范围内，对薄层鉴别无明显影响（图5）。
薄层鉴别方法学试验的结果表明，金水六君煎物质基准中半夏的薄层鉴别方法重现性良好，分离效果较好，斑点清晰，阴性对照无干扰。
2.2.6 20批样品的薄层鉴别 按“2.2.2 薄层色谱条件”试验，对20批金水六君煎物质基准进行薄层鉴别，20批供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同顏色的斑点（图6、图7）。
2.3 陈皮的薄层鉴别
2.3.1 溶液的配制 供试品溶液：取金水六君煎物质基准粉末10.0 g（批号：JS001），加三氯甲烷50 mL，超声30 min，滤过，弃去三氯甲烷液，残渣挥尽三氯甲烷，加无水乙醇超声提取2次（50 mL，25 mL），每次30 min，滤过，合并无水乙醇液，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解。
陈皮对照药材溶液：另取陈皮对照药材0.50 g，加三氯甲烷50 mL，超声30 min，滤过，弃去三氯甲烷液，残渣挥尽三氯甲烷，加无水乙醇25 mL，超声30 min，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解。
对照品溶液：另取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液。
阴性溶液：按金水六君煎配方称取除陈皮外的其他药材，按“2.1”项下金水六君煎物质基准制备方法，制成缺陈皮阴性物质基准。取缺陈皮阴性物质基准适量，按“2.3.1”项供试品溶液制备方法，制成缺陈皮阴性溶液。
2.3.2 薄层色谱条件 照薄层色谱法［8］试验，吸取“2.3.1”项下供试品溶液和缺陈皮阴性溶液各10 μL、对照药材溶液2 μL和对照品溶液5 μL，分别点于同一用0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）为展开剂，预饱和20 min，展至约3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上层溶液为展开剂，预饱和20 min，展至约8 cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（图8）。
2.3.3 不同薄层板考察 取0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板，按“2.3.2 薄层色谱条件”试验，种薄层板的薄层色谱信息基本一致，不影响该方法检视结果，选定青岛谱科0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板（图9）。
2.3.4 供试品溶液点样量考察 供试品溶液点样量分别为2 μL、6 μL、10 μL、14 μL，按“2.3.2 薄层色谱条件”试验（图10）。综合考虑，供试品溶液点样量为10 μL。
2.3.5 展开环境的耐用性考察 不同温度的比较：分别在4 ℃、25 ℃和40 ℃，预饱和20 min，展开，其余条件同“2.3.2 薄层色谱条件”试验。结果表明，温度在4～40 ℃范围内，对薄层鉴别无明显影响（图11）。
不同湿度的比较：在室温25 ℃下，分别在相对湿度75.3%、43.2%和18.0%预饱和20 min，展开，其余条件同“2.3.2 薄层色谱条件”试验。结果表明，相对湿度在18.0%～75.3%范围内，对薄层鉴别无明显影响（图12）。
薄层鉴别方法学试验结果表明，金水六君煎物质基准中陈皮的薄层鉴别方法重现性良好，分离效果好，斑点清晰，阴性对照无干扰。
2.3.6 20批样品的薄层鉴别 按“2.3.2 薄层色谱条件”试验，对20批金水六君煎物质基准进行薄层鉴别，20批供试品色谱中，在与橙皮苷色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（图13）。
3 讨论
金水六君煎处方中，半夏为佐药，辛温，具有燥湿化痰的功效［9］。回流法制备半夏薄层样品，操作繁琐，提取溶媒三氯甲烷和展开剂苯均毒性较大［6］，不利于环保。该研究采用超声法提取样品，提取溶媒和展开剂均换成低毒性溶剂，方法简便可行，所得供试品溶液重现性较好。结果显示，半夏的薄层分离效果较好，主斑点清晰、Rf值适中。
陈皮为佐药，苦辛温散，具有消水化痰的功效［9］。橙皮苷为陈皮的质量标志物之一［10］，具有抗氧化、抗炎、促胃动力作用等药理活性［11-14］，橙皮苷是陈皮药材薄层鉴别的特征性成分。本实验先用三氯甲烷超声提取杂质，再用无水乙醇超声提取橙皮苷，供试品溶液重现性好。陈皮薄层鉴别经二次展开，各斑点分离良好，主斑点清晰。
藁本内酯和阿魏酸为当归的化学成分。藁本内酯具有挥发性，稳定性较差，在金水六君煎物质基准样品和后期复方制剂制备、储存时，易丢失，金水六君煎物质基准的薄层鉴别未检测出藁本内酯；阿魏酸是当归药材薄层鉴别的特征性成分和含量测定的指标成分，但金水六君煎中当归和陈皮药材均含有阿魏酸，上述两种成分均不能作为当归药材的薄层鉴别成分。在2020年版《中国药典》（一部）茯苓、含茯苓药材的成方制剂中，茯苓药材的薄层鉴别均以茯苓为对照药材，乙醚为提取溶媒，提取脂溶性成分。金水六君煎为水煎液，茯苓中脂溶性成分在其水煎液中含量极低，薄层试验未检测出。后期，应重点关注金水六君煎及其药材（当归、茯苓）的化学成分研究进展，开展薄层鉴别试验，力争找到金水六君煎中当归和茯苓的薄层鉴别特征性成分。
4 结论
本文建立的金水六君煎中半夏和陈皮的薄层鉴别方法，药材特征斑点清晰，阴性无干扰。此方法简单可行，重复性良好，为金水六君煎的质量标准完善和提升提供参考。
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（收稿日期：2023-07-03 编辑：陶希睿）
