高效液相色谱UltiMate3000直接进样分析水中萘及3D数据分析实践

【摘要】PPB级浓度的萘可以使用高效液相色谱仪器进行定量分析。本实验采用赛默飞UltiMate3000色谱仪进行直接进样分析，集中在操作技巧方面，包括仪器平衡、工作条件设置、结果数据处理等。实验给出定量分析性能指标包括校准曲线、检出限和加标回收率。浓度性检测器通过比较发现，峰高的精密度高于峰面积。使用Hypersil ODS C18色谱柱，在柱温度40℃、220 nm的紫外波长条件下，以1 mL/min的甲醇为淋洗液方案进行操作，直接进样获得分析性能为0.29μg/L的检出限以及4.5%的相对标准偏差。

【关键词】萘；直接进样；高效液相色谱；DAD数据

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.003

Practice of HPLC Determination of Naphthalene in Water under UltiMate3000 in Direct Injection and Application of 3D Data Analysis

YANG Gangming

（Xiaogan Ecological Environment Monitoring Center of Department of Ecology and Environment of Hubei Province， Xiaogan 432100， China） Abstract： PPB grade concentration of naphthalene can be quantitatively analyzed using high-performance liquid chromatography instruments. This practice uses a direct injection analysis operation on the Thermo Fisher UltiMate3000 chromatograph. The practice mainly focuses on operational techniques， including instrument balance， working condition settings， and result data processing. It provides quantitative analysis of performance indicators， including calibration curves， detection limits， and spiked recovery rates. The precision of the concentration detector is higher than that of the peak area through comparison. Using a Hypersil ODS C18 chromatographic column， operating at a column temperature of 40℃， a UV wavelength of 220 nm， and a methanol elution solution of 1 mL/min， a detection limit of 0.29μg/L and a relative standard deviation of 4.5% were obtained by direct injection.

Keywords： Naphthalene； direct injection； high performance liquid chromatography； DAD data

萘，化学式C10H8，白色易挥发晶体，25℃时饱和蒸汽压为0.0131 kPa，光解最大吸收波长为310.5～220.5 nm[1]，是最简单的双苯有机物。萘是工业生产中重要的稠环烃，主要用于生产苯酐、萘酚和萘胺，以及作为生产染料中间体，也是卫生球的原料之一。萘应用于水泥产品中可以增加水泥塑性变形而不降低其强度。萘的IARC致癌性评论：G2B，可疑人类致癌物，是PAHs统计构成之一[1-2]。研究人员在地表水、土壤中均检出了萘的存在[3-7]。水中萘的检测方法有气相色谱-质谱法和高效液相色谱-荧光检测器-紫外检测器法。实验室检测一般参照HJ 478—2009《水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法》规定的方法，适合低浓度含量萘的水质检测。GBT14848—2017《地下水质量标准》中规定Ⅰ类地下水中萘的标准限值为1μg/L.

本实验使用赛默飞公司UltiMate3000型（简称U3000）高效液相色谱仪建立直接进样方式分析水中萘。U3000配置由泵系统、进样器、柱箱、紫外-可见光光度检测器、荧光检测器、二极管整列检测器（DAD）构成。二极管整列检测器波段范围为180～900 nm。U3000配套的软件工作站包括一般的样品进样以及谱图分析计算，还包括由DAD检测器获取的3D数据的分析功能。

本次分析使用紫外监测器，波长采用JJG 705—2014《液相色谱仪》检定规程通用的监测波长设置进行分析，同时根据U3000的配置特征打开DAD采集数据，然后利用3D分析模块分析最佳光波，最后使用最佳光波进行再分析。

1主要部件和试剂

色谱柱：赛默飞Hypersil ODS C18 5μm 2.1 mm×200 mm反相色谱柱。检测器：赛默飞SPD 3400 D3D UV-VIS检测器。甲醇：MERK，色谱纯，为减少甲醇的消耗，配置一定比例水，采用实驗室纯水机制取的超纯水。

2仪器参数

1）平衡预操作。对全部流动相通道进行反冲洗以消除气泡（存在气泡时，仪器会持续告警Pressure is below limit，同时仪器不能工作），然后清洗注射器、缓冲环、进样器外部。

2）平衡内容。仪器按照厂家推荐参数方法进行，设置100%甲醇为淋洗方案，将色谱柱维持为40℃，打开紫外线灯，设置检测器紫外波长值为254 nm，带宽为1 nm。打开泵维持流速在1.0 mL/min，同时打开基线监控程序观察系统各状态，进样体积设置为10μL。

3）平衡时间。在完成平衡前期操作后进行系统平衡。平衡时间为30 min，进样出峰不稳定，存在杂峰，见图1。

平衡时间为1 h，出峰表现稳定，见图2。

4）流动相比例。使用20%的水和80%的甲醇作为流动相，在谱图中会多出至少一个峰，即为溶剂水的峰，由于水的极性大于萘，根据反相色谱的规则，水峰会先出，同时在不同时间会出现一些杂峰，见图3。

3谱图分析

使用100%的甲醇为淋洗液，流量为1.0 mL/min，进样量为10μL，紫外检测波长为254 nm波长，同时开启3D扫描。连续进行多次进样，出峰情况良好。出峰时间为2.377 min，保留时间稳定，保留时间相对标准偏差为3%，峰面积相对偏差在13%，见图4。

4波长调试

使用254 nm紫外波长进行检测后，重新使用220 nm紫外波长进行进样分析，维持其他条件不变，出峰稳定状态不变。可以看出，峰的形态稍有变化，上升阶段曲线相对下降阶段曲线变得陡峭，见图5。

53D数据的使用

U3000可以提供180～900 nm范围的连续波长吸收检测。前述进样分析时，开启3D数据，对应需要设置波长范围，由于萘吸光响应在紫外区域，因此对应设置为190～400 nm。与传统色谱图工作不同，检测器不仅仅在沿时间轴捕获一个特定波长的吸光度，而是沿时间轴捕获全部190～400 nm范围全部波长（精度可设，默认为1 nm）对应的全部吸光度系列值。系统获得的吸光度为特定时间和特定波长的响应量，每个数据对组合了时间、波长和吸光度，称为3D数据。利用此数据，可以提取出两个方式的二维数据曲线：一个表现为常见的色谱图，即时间和吸光度信号的对应关系，这个色谱图可以基于任意一个波长点；另一个表现为波长和吸光度信号的二维图，即光谱图，这个光谱图可以基于任意时间点。利用第一个图可以一次进样完成全部波长的扫描，通过工作站软件可以定性确定最佳波长，而且定量出对应的色谱数据。图6中，O线表示进样时的波长对应峰的形态，A线表示希望得到的任意波长的对应的峰的面积形态，这样可以对比出最佳波长。使用这个方法得到吸光度最佳的波长为220 nm。

利用第二个图（即光谱图）可以得到物质对全部波段光波吸收的特征信息，进一步可以得到不同物质在实验环境下的特征信息。这些信息如同物质的“指纹”，可对未知物质鉴别做定性分析。图7显示了在190～400 nm范围内萘的吸收光谱图。图中可以看出萘在波段范围内出现两个显著的可吸收区域，此图也可以看出最佳吸收点在220.16 nm。

工作站软件提供平台将这个光谱图进行归档入库，这样可以用于鉴别未知物质，见图8。利用光谱库进行物质鉴别结果，见图9。

利用3D數据还可以分析出峰的另外一个重要指标，即峰匹配度。峰匹配度表示峰最大值处的光谱与前沿和托尾上光谱的相似度。从工作站软件计算出的峰拖尾处的峰匹配度值中可以看出，峰拖尾处匹配度为946.6。

6定量分析质量控制

1）相关系数

提长山[8]使用3×10-7、1×10-7、4×10-7、2×10-7、0.5×10-7g/mL标准溶液进行相关分析得出相关系数为0.9996，但未做检出限。本次实验使用1、2、4、6、8、10μg/L的标准溶液进行分析，以峰面积进行定量，得到标准曲线为y=1.2998x-0.2739，相关系数为0.9994。

2）检出限

提长山使用1×10-7g/mL以及1×10-4g/mL标准溶液进行7次进样测试，得到相对标准偏差分别为2.08%和0.02%。参考HJ 1073—2019《水质萘酚的测定高效液相色谱法》萘酚中检出线为0.2μg/L，预计检出限为0.2μg/L。使用1μg/L的标准溶液进行重复进样10次，计算出检出限为0.29μg/L。

3）精密度

使用1μg/L标液进行重复进样10次，计算峰面积和峰高的相对标准偏差。

由表1可见，峰高的相对标准偏差明显优于峰面积。这种情况与检测器原理有关。UVD检测器为浓度型检测器，峰高相对稳定。因为峰面积和淋洗液速率的乘积值相对稳定，所以受淋洗液器件稳定性的影响，当流速出现波动时，峰面积会随之波动[9]。

4）加標回收率

使用2μg/mL，8μg/mL两个浓度系列进行加标回收率计算，结果全部回收率在78%～89%之间。

7实际水样分析

直接预处理后，采用直接进样方式进行进样分析[10-12]，选择6个地表水水样进行测量，使用光谱库进行物质鉴别。最终萘的检测结果显示未检出。

选择3家化工厂水样进行现场水样处理，根据HJ 91—2002《污水采样技术规范》经过0.45μm滤膜过滤预处理后，添加抗坏血酸低温保存，实验室再经过0.22μm滤膜过滤后经过稀释后进样，一个样品检出萘的含量在12.1μg/mL。

8结束语

使用UltiMate3000配置Hypersil ODS C18将水样直接进样进行萘分析，以甲醇为流动相，1.0 mL/min流速，柱温40℃，在220 nm波长可以得到最大的吸光度响应，实验条件下检出限测定为0.29μg/L，保留时间相对标准偏差为3%。

仪器响应在样品浓度在1～10μg/L范围有较好的线性关系，可以满足地下水水质的检测。建议使用峰高进行定量分析。使用3D功能可以一次获得全部波长数据，进行光谱分析，建立特征物质光谱库。

【参考文献】

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【作者简介】

杨刚明，男，1970年出生，学士，研究方向为环境监测综合分析评价。

（编辑：李钰双）