纳米药物包封率测定中的影响因素分析及对策

★ 温沁楠 张锐 魏朵朵 王毓婕 孙勇兵（.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004；.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 330006）

纳米药物一般是将药物溶解、包裹在高分子材料中或是吸附在载体表面形成的载药纳米粒，其粒径在10～1 000 nm。将药物制成纳米制剂可以有效解决其溶解度、渗透性、稳定性差等问题，并且可以实现药物靶向、缓释、提高生物利用度等目的［1-2］。目前有超过51 种纳米药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准［3］，但是同期的申请量却多达359 项［4］。仅有1/7 的申请获得批准，主要原因之一是早期评价纳米药物体外和体内性质的标准化测试方案存在不足，可能导致不可预测的治疗结果，从而增加了临床试验失败的风险，这些问题阻碍了纳米药物的开发［5-6］。

在所有纳米药物体外研究实验中，包封率是关键性评价指标，为纳米药物制剂成型工艺提供了关键信息。因此必须精确量化，合格的包封率是纳米药物能作为药物传递系统的先决条件。国家药监局新药审评中心2021 年8 月27 日发布的《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》特别强调了应根据纳米药物的特点对包封率进行方法的适用性研究和验证。该研究的难点在于游离药物和载药纳米粒的分离，既要保证分离完全，又要保证包封药物不泄漏，这是一项具有挑战性的工作。而目前尚无规范的药典方法或监管标准，以不同的分离方法测定包封率所得到的结果不一致，由此引发了人们对包封率准确度的质疑［7］。本文通过综述目前包封率测定的主要方法、方法学验证中存在的缺陷、导致准确度问题的因素以及应对策略，为选择最佳的包封率测定方法提供参考。

1 包封率的计算方法

目前包封率的测定策略主要是通过间接法测定，即采用某种分离手段将游离药物和载药纳米粒分离，再测定游离药物的含量，最后通过质量平衡计算纳米药物的包封率［包封率=（W总药量-W游离药量）/W总药量×100%］。但是由于载药纳米粒的多分散性，无法获得（标定）不含游离药物相应的定量用载药纳米粒对照品，因此仅能以游离药物为指标进行方法学验证。但需要特别注意的是，使用该策略的前提是载药纳米粒在分离过程中不发生药物的泄漏。

2 游离药物的分离方法

2.1 离心

离心法是基于粒子重量的差异，在离心力的作用下不同重量粒子沉降速度不同而使密度小的部分浮在上，密度大的部分沉降在下，以此分离游离药物与载药纳米粒的方法，其优点在于操作简单，分离过程中纳米药物不被稀释，药物溶出的可能性较低。一般来说，经过离心后，溶解在介质中的游离药物往往存在于上清部分，而纳米粒子则沉淀在下。但也存在药物溶解度极小，游离药物沉降在下，被包封的纳米粒子处于上清的情况［8-9］，后者不再适用于高速离心法。故应根据药物的性质选择合适的离心力（或是离心转速）。

2.2 透析

透析法与反透析法均是利用透析袋对分子量的选择性，将游离药物与载药纳米粒分离。载药纳米粒由于粒径较大被阻碍，而游离药物会在浓度梯度差的作用下，由浓度高处向浓度低处扩散，达到平衡后即可测得游离药物含量，但达到分离平衡的时间在所有分离方法中最长，最可能出现伴随在分离过程中载药纳米粒内药物溶出的问题。

2.3 超滤

超滤法又分为超滤离心法、加压超滤法、中空纤维超滤法等［7］。与透析法相似，也是利用超滤膜的分子截留量大小将游离药物与载药纳米粒分开，使游离药物透过超滤膜，但其借助外力加快了分离的过程。游离药物由于粒径较小、分子量小，可以透过超滤膜，而载药纳米粒则被截留在超滤膜上。此方法兼具离心法的优点，借助超滤膜的截留分子量的特性，相比于离心法分离的速度更快，也更容易判断分离的终点。

但需要注意的是，如果游离药物会发生缔合、结晶导致流体尺寸的变化，则需要根据药物的性质合理使用滤膜。如陈倩倩［10］利用游离的白藜芦醇绝大部分是以微晶形式存在，通过微孔滤膜过滤截留游离的微晶，而使载药乳脂体通过滤膜。实验表明，极小部分溶解于水中的白藜芦醇对包封率测定结果无明显影响。

2.4 分子排阻

分子排阻法（size exclusion chromatography，SEC）是利用被分离物质流体力学尺寸差异而将游离药物与载药纳米粒分离的方法［11］。一般来说纳米粒的粒径大于游离药物，当粒子粒径大于凝胶孔径时，便无法进入凝胶内部，只能顺着凝胶颗粒外部缝隙流出，而游离药物分子量小，被吸附进凝胶内部，在洗脱剂的作用才下逐渐被洗脱，所以在凝胶柱上纳米粒先被洗脱流出，小分子药物后出。但是由于分离的过程引入了色谱流动相和固定相两个影响因素，SEC 的应用也需要较长的洗脱时间和较大的洗脱体积，这导致样品被稀释并伴有药物的泄漏［12-14］。实际使用过程中除了凝胶柱层析法外，为达到快速分离目的，还有微柱离心法可供选择。微柱离心法可加快分离的速度，可以同时并行处理多个样品，但需注意离心作用可能导致柱床断裂［15］。

2.5 非对称场流分析法

非对称场流分 析（asymmetric flow field flow fractionation，AF4）也是根据纳米粒的流体力学尺寸进行细分的一种技术，场流分离的分离通道中无固定相填料，不同尺寸的样品在载液的层流作用下，分布在液流抛物线剖面不同高度的位置上，因此不同尺寸分析物具有不同的保留时间。同时垂直于半透膜的方向会产生交叉流，大粒子扩散作用弱，趋向于靠近积累壁，因而更晚被洗脱。相比于SEC，此方法不存在因填料孔径而导致的排阻极限的限制，几乎可以分离和表征横跨整个胶体尺寸范围的复杂样品。但是和SEC 的情况相似，此法也存在分析时间较长的问题，耗时常在1 h 以上，而长时间的稀释过程易导致纳米制剂的药物泄漏，特别是油水分配系数较低的药物更会发生这种情况［16］。膜材如选择不当还可能导致游离药物从半透膜渗漏。

2.6 其他

除以上方法外，通过分离介质、游离药物和载药纳米粒三者间相互作用的差异，也有一些特异性的分离方法被运用于测定纳米药物的包封率。井水泉［17］运用D101 大孔树脂能特异性吸附游离药物而不吸附载药脂质体的特性，上样后用少量蒸馏水将脂质体洗脱下来，而游离药物留在树脂柱上，使二者分离。刘敏等［18］基于纳米粒的包裹不改变紫杉醇的紫外吸收特性，运用荧光素示踪法结合HPLC 直接测定，将游离紫杉醇与紫杉醇纳米粒在C18同时定性定量测定，并且交叉验证了所测定的包封率值，结果无明显差异。吴瑾瑾等［19］根据猕猴桃根多糖带有负电性这一特征，用阴离子交换树脂分离游离药物与脂质体。李文静等［20］利用硫酸长春新碱在溶液状态下可形成有机铵盐离子，被阳离子交换树脂完全吸附，以达到分离游离硫酸长春新碱目的。更有学者利用多聚阳离子鱼精蛋白与带负电的脂质体纳米粒产生絮凝作用，使载药脂质纳米粒沉淀，离心后取上清测定游离药物含量［21-22］。

3 影响因素

3.1 药物的溶解性

药物的溶解性是影响包封率测定的一大原因，在使用超速离心法测定包封率时，脂溶性药物难以溶解在分散介质中，在巨大的离心力作用下沉降在底部，难以与密度较大的载药纳米粒分开，这时通过测定上清中游离药物含量而计算包封率的结果会偏大。使用超滤法与透析法时，脂溶性药物由于难以溶解在分散介质中，聚集而成的微粒容易堆积、阻塞超滤膜与透析膜的孔径，阻塞游离药物的透出，也会导致测得的包封率值偏大。

3.2 密度

根据沉降理论公式，离心法只适用于载药纳米粒的密度与离心液体介质密度不同的载药纳米粒的沉淀。这就需要专业离心仪器来支持超高的离心力。因此，在一般的操作条件下，特别是当颗粒密度与液体介质相似时，超速离心常常导致分离效率低下［11,23］。并且加样回收实验无法证明 “上清液” 中是否还含有载药纳米粒，也无法证明较长时间的超速离心是否导致了药物泄漏。

3.3 溶剂量

运用超滤离心法测定包封率时，浓差极化是阻碍游离药物透过膜的主要因素，超滤过程中，超滤膜内药物逐渐浓缩，可能形成胶束，进一步使低分子量物质难以透过超滤膜，使包封率测定结果偏大［24］。而葡聚糖凝胶柱层析法与透析法［25］皆是由于洗脱液体积过大或透析介质体积过大，使载药纳米粒被大量稀释，致使部分纳米粒破裂，包载的药物泄漏，使游离药物含量增大，测得的包封率会比真实值小。因此分离溶剂的量对包封率测定结果也有明显的影响。

3.4 分离时间

SEC、AF4 和透析法分离时间均较长，但在游离药物与载药纳米粒分离过程中，不可避免地伴随着载药纳米粒内药物的溶出（释放），因此，分离时间应该尽可能短。但分离时间不够又无法使游离药物与载药纳米粒完全分开，所测得的包封率往往偏大。此外，在使用超速离心法时，离心时间过长使纳米粒长时间处于很大的离心力下［26］，强大外力可能致纳米粒破裂，包载药物泄漏，使测得的包封率偏小。离心法中长时间的离心也可能导致纳米粒聚集，阻碍了游离药物的分离，使测得的包封率过大。离心时间不够又无法将全部载药纳米粒完全沉淀，分离不完全，测得的包封率偏小。因此分离时间的优化尤为重要。

3.5 纳米粒的结构稳定性

纳米粒在长时间的高速离心［26］、大量稀释［25］、不合适洗脱剂的作用下，均可能破裂使其中包载的游离药物泄漏，使测得的包封率偏小，因此在考察游离药物回收率的同时，还需要考察载药纳米粒在分离过程中结构的变化。

3.6 膜的孔径和膜材质

对于透析、超滤离心、AF4 法均涉及膜材的选择，如果在方法学验证中为追求游离药物的回收率符合验证要求而选择过大孔径的膜，也可能导致载药纳米粒透过到滤液中，造成错误的结果［11］。因此，必须根据游离药物的分子量，对分离膜的截留分子量进行限制，一般不能超过游离药物分子量的10 倍。

膜材质的选择问题也需要注意，从实验室常用的Millipore 及Amicon 超滤离心管说明书中得知，其常用的膜材质为聚醚砜（PES），仅适用于生物液体及水溶液，对甲醇的耐受仅≤60%，所以实验中使用甲醇作为溶剂并不恰当，结果表明超滤离心法测包封率的重复性一般，推测实验中超滤膜的结构可能已发生变化［22,27］，因此该研究得到的包封率结果的准确性有待进一步考察。

4 应对方法

4.1 通过方法学验证可以控制的因素

可以得知，分离条件选择不当，会导致包封率测定结果偏离真实值。所以对游离药物与载药纳米粒的分离方法进行方法学验证是必要的。例如在苦参碱冻干脂质体的包封率测定中［28］，分别使用了透析法、葡聚糖凝胶柱色谱与微柱离心法，每种方法都依次进行了条件优化及方法学验证，确定了透析袋及空白脂质体对游离药物均没有吸附、截留作用，透析时间能够使游离药物释放完全；确定了葡聚糖凝胶柱对游离药物没有吸附作用，空白脂质体的加入不影响游离药物的洗脱，合适的柱体积，洗脱液的用量及合适的上样量；确定了制得的微柱对空白脂质体没有截留作用，可以将载药脂质体与游离药物分开的离心条件，认为此3 种方法都可行。但是3 种方法最终的测定结果并不一致，通过比较，透析法测定包封率偏低，推测与脂质体中的药物泄漏有关，同时说明药物泄漏问题及影响因素难以通过常规方法学验证发现。

为进一步提高方法学验证的可靠性，还需要对分离过程中载药纳米粒结构的稳定性进行考察，例如庄英华等［29］使用超滤离心法测定连翘酯苷脂质体包封率，通过方法学验证，证明超滤膜对连翘酯苷没有吸附。其可进一步利用定磷法测定滤液中的磷脂含量［30］，如为阴性，则可确认所选择的超滤离心管可以完全截留住脂质体，并且脂质体结构完整没有发生破裂，这样药物泄漏可能性就大大降低。

4.2 目前尚不能通过常规方法学验证发现的因素

在现有的间接测定包封率的分离方法中，水溶性强的药物制备的纳米制剂比较容易出现方法学考察验证失真的问题，因为只要膜或者填料不对游离药物产生非特异性吸附，那么通过加标回收的方法，回收率测定的结果就一定能满足方法学验证的要求。但分离过程中是否存在载药纳米粒中药物的泄漏问题却不可得知。

为了克服这个缺陷，笔者认为必须采用更为直接的方法，主要是利用被测药物特殊的结构，依靠光谱学或电化学技术，不经分离直接地测定纳米制剂中游离药物的含量。比如COULIBALY 等［31］利用核磁共振定量硼谱（11B-qNMR）基于测定硼替佐米（BTZ）海藻酸钠微粒中的BTZ 含量，包封于海藻酸钠中的BTZ，由于分子的转动受到聚合物的抑制，谱峰展宽不干扰游离BTZ 的测定。AGRAHARI等［32］也采用了类似的思路，在31P-qNMR 中游离的含磷化合物会产生一个尖峰，而被包封的药物谱峰会展宽，可以方便区分游离药物和包封药物。如果能找到合适峰位的吸收峰代表游离药物的含量，1H-qNMR 也可以用于游离药物的直接定量［33］。其他的方法还包括电化学方法，如MORA 等［34］采用伏安法测定了直接阿霉素的脂质体中游离药物的含量。但这些方法极度依赖药物及载体辅料的结构特异性和差异性，方法的专属性很强但通用性仍然较差。因此，还是需要对载药纳米粒和游离药物在物理、化学性质等方面的不同点进行挖掘，开发出具有不同工作原理的新方法，在各种方法之间进行交叉验证，保证测定结果更为准确。

5 小结

对同一纳米药物进行包封率测定时，应当分别测试不同的分离方法，如所得结果具有明显差异，则提示应当根据待测物的特性以及结合实验实际优选合适的测定方法，而非仅仅选择得到包封率测定结果最高的方法。

总的来说，在所有的间接测定法中，超滤离心法是现阶段最佳的分离方法，其分离时间最短，防止包封药物在分离中的释放，其分离过程中也未对纳米粒进行稀释，只要能通过选择合适的超滤膜避免非特异性吸附，并结合对载药纳米粒结构稳定性的考察，二者相互验证，便能得到现阶段最能逼近真实值的包封率测定结果，是可以采用的通用方法。也相信在后续的实验中科研工作者能摸索出更多有效的方法在纳米药物包封率测定的实际应用中发挥作用。