LncRNA FEZF1-AS1调控特发性肺间质纤维化的机制研究*

满君， 宋龙飞， 刘永全

（潍坊医学院附属医院 1.呼吸内科， 2.康复医学科， 山东 潍坊 261035）

特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是指慢性、进行性、纤维化性及原因不明的肺间质性病变，表现弥漫性肺泡炎、肺泡结构紊乱、上皮-间充质相互作用（epithelial interstitial transition, EMT）、成纤维细胞过度增生及细胞基质过度沉积，最终导致弥漫性间质纤维化[1]。IPF 是肺系疑难重症疾病，确诊后平均生存期为3 年左右，5 年生存率为30%～50%。近年来国内外学者认为，IPF 发病机制主要与EMT 有关，EMT 指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞表型转变、细胞极性消失、迁移运动能力提高的现象[2-3]。长链非编码RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一类转录本长度>200 nt、不编码蛋白的RNA，其大量存在于真核生物和哺乳动物细胞中，广泛参与生物体内各种重要的生理过程[4]。研究发现，FEZ 家族锌指1-反义RNA 1（LncRNA FEZF1-AS1）在多种肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT 中发挥重要作用，调控肿瘤细胞EMT 过程相关的多种关键分子和信号通路。MicroRNA（miRNA）是一种重要的非编码小RNA，广泛参与多种生物学功能的调控。MicroRNA-200c-3p（miR-200c-3p）在多种疾病EMT过程中的作用逐渐被揭示，研究发现，miR-200c-3p在心肌梗死及乳腺癌、胃癌、胆囊癌等EMT 转化过程中发挥重要作用[5-7]。然而，LncRNA FEZF1-AS1在IPF 中的作用尚无研究，且LncRNA FEZF1-AS1 是否通过miR-200c-3p 发挥作用尚不清楚。本研究分析LncRNA FEZF1-AS1 在IPF 中的表达模式和生物学功能，探讨IPF 的发病机制，为寻找IPF 有价值的治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及培养

A549 细胞购自上海富衡生物科技有限公司，A549 细胞培养于含10%胎牛血清、100 u/mL 青霉素、100 u/mL 链霉素的DMEM/F12 培养基中，在恒温培养箱中以5% CO2、37 ℃及饱和湿度条件下松盖培养，当细胞长至80%铺满时再进行后续实验。

1.2 主要试剂及仪器

转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）（上海近岸生物科技有限公司），DMEM/F12 液体培养基（美国HyClone 公司），胎牛血清（美国GIBCO 公司），CCK-8 检测试剂盒（日本DoJinDo公司）；Transwell 嵌套小室（美国Corning 公司），TRIzol（北京全式金生物技术有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），引物合成（上海捷瑞生物工程有限公司），FastKing cDNA 第一链合成试剂盒、Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit 试剂盒（苏州锐博生物科技有限公司），Lipofectamine 6000™ 转染试剂（上海碧云天生物技术有限公司），Si LncRNA FEZF1-AS1 转染质粒（广州市锐博生物科技有限公司），Si LncRNA FEZF1-AS1 NC（对照）转染质粒（广州市锐博生物科技有限公司），miR-200c-3p 引物序列（广州市锐博生物科技有限公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及GAPDH 抗体（美国Proteintech公司），辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（上海碧云天生物技术有限公司）。二氧化碳培养箱（日本SANYO），酶标仪（美国Thermo 公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染及分组 将原始浓度为10 μg/mL的TGF-β1稀释500 倍后建立TGF-β1（20 ng/mL）作用于A549 细胞48 h 诱导肺间质纤维化细胞模型，将细胞分为空白对照组和模型组。细胞接种于6 孔板内进行培养，当细胞生长至融合度达到70%～90%时进行转染，构建LncRNA FEZF1-AS1 突变质粒及空白质粒，依据Lipofectamine 6000™试剂盒说明书进行转染，将模型组细胞分为TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组（转染质粒）及TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组（转染空白质粒），Blank 组（不做任何处理的A549 细胞）。A549 细胞转染48 h 后采用qRT-PCR 检测细胞转染效率，用于后续实验。将A549 细胞分组为Blank 组、Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组、Si LncRNA FEZF1-AS1 组。为保证结果的准确性，本研究又将Si LncRNA FEZF1-AS1 组设置3 组重复实验，即Si LncRNA FEZF1-AS1-1 组、Si LncRNA FEZF1-AS1-2 组、Si LncRNA FEZF1-AS1-3 组，共分为5 组观察转染效率。

1.3.2 qRT-PCR 检测LncRNA FEZF1-AS1 和miR-200c-3p 表达 采用TRIzol 试剂从细胞中提取总RNA，分别应用FastKing cDNA 第一链合成试剂盒及miRNA cDNA 第一链合成试剂盒说明书操作逆转录成cDNA，根据PCR 试剂盒说明书进行qRT-PCR反应，反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。记录Ct值，采用2-ΔΔCt进行相对定量分析，分别以GAPDH 和U6 作为内参计算LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 和miR-200c-3p mRNA 相对表达量，实验重复3 次。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.3.3 CCK-8 法检测细胞增殖 将细胞分组为Blank 组、TGF- β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组及TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组。A549 细胞转染24 h 后，胰酶消化细胞数调整至4×104个/mL，100 μ L/well 接种于96 孔板同时加入TGF- β120 ng/mL，分别在培养0、24 和48 h 时每孔加入10 μL CCK-8 溶液，4 h 后使用酶标仪测定450 nm波长处各孔吸光度（OD 值）。

1.3.4 细胞划痕检测细胞迁移实验 将细胞分组为Blank 组、TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组及TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组。A549 细胞转染24 h 后，将细胞悬液接种到6 孔板中，加入TGF-β120 ng/mL，细胞生长至铺满孔底后，用10 μL的无菌微量移液器吸头垂直在消毒后在细胞板上划痕，并将细胞洗涤3 遍，加入无血清培养基，二氧化碳培养箱中继续培养。倒置显微镜下观察0、48 h各组细胞的变化。划痕愈合率（%）=（0 h 划痕面积- 48 h 划痕面积）/0 h 划痕面积。

1.3.5 Transwell 实验检测细胞迁移 将细胞浓度调整为2×105个/mL，每组细胞数量为1×105个/孔。配制Transwell 上室液和下室液：上室加无血清培养基，下室是TGF-β120 ng/mL 含血清完全培养基，上室液每孔200 μL，下室液每孔800 μL。将上层小室放入下层小室，细胞计数后将细胞铺在上层小室中。在细胞培养箱中培养48 h 后，取出上室，用棉签擦去上室底部膜表面上的细胞，800 μL 甲醇中固定10 min，采用吉姆萨染色液染色细胞，荧光倒置显微镜下计数、拍照。

1.3.6 Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白相对表达量 细胞分组后，采用裂解液裂解每组细胞，裂解完后，于4 ℃下12 000 r/min离心15 min，提取各组细胞蛋白，采BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳分离后，采用湿转法转到PVDF 膜，用含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF 膜，室温摇床封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST 充分洗涤PVDF 膜后加入二抗37 ℃摇床孵育2 h。TBST 洗涤后加入ECL 显影，采用Image J 软件进行灰度值分析，GAPDH 作为内参蛋白，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验或单因素方差分析或析因设计的方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 空白对照组与模型组细胞E-cadherin、Ncadherin、Vimentin蛋白表达的比较

Western blotting 检测结果显示，空白对照组与模型组细胞E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 蛋白相对表达量比较，经t检验，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组细胞N-cadherin、Vimentin 蛋白相对表达量高于空白对照组（P<0.05）；模型组细胞E-cadherin 蛋白相对表达量低于空白对照组（P<0.05）。见表2 和图1。

图1 空白对照组与模型组细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达

表2 空白对照组与模型组细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量的比较 （±s）

表2 空白对照组与模型组细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量的比较 （±s）

组别空白对照组模型组t 值P 值E-cadherin蛋白0.66 ± 0.01 0.46 ± 0.09 3.638 0.020 N-cadherin蛋白0.44 ± 0.04 0.72 ± 0.02 6.688 0.003 Vimentin蛋白0.61 ± 0.009 0.79 ± 0.02 10.020 0.001

2.2 空白对照组与模型组细胞LncRNA FEZF1-AS1、miR-200c-3p基因表达的比较

qRT-PCR 实验结果显示，空白对照组与模型组细胞LncRNA FEZF1-AS1 和miR-200c-3p mRNA 相对表达量比较，经t检验，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组细胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 相对表达量高于空白对照组（P<0.05）；模型组细胞miR-200c-3p mRNA 相对表达量低于空白对照组（P<0.05）。见表3。

表3 空白对照组与模型组细胞LncRNA FEZF1-AS1、miR-200c-3p mRNA相对表达量的比较 （±s）

表3 空白对照组与模型组细胞LncRNA FEZF1-AS1、miR-200c-3p mRNA相对表达量的比较 （±s）

组别空白对照组模型组t 值P 值LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 1.35 ± 0.09 1.73 ± 0.03 4.269 0.013 miR-200c-3p mRNA 1.08 ± 0.003 0.20 ± 0.01 119.000 0.000

2.3 各组LncRNA FEZF1-AS1转染效率的比较

5 组转染效率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。两两比较结果示，Si LncRNA FEZF1-AS1-1 组、Si LncRNA FEZF1-AS1-2 组、Si LncRNA FEZF1-AS1-3 组的LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 相对表达量低于Blank 组（P<0.05）；且Si LncRNA FEZF1-AS1-1 组、Si LncRNA FEZF1-AS1-2组、Si LncRNA FEZF1-AS1-3 组的LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 相对表达量也低于Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组（P<0.05）。见表4

表4 各组细胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA相对表达量的比较 （±s）

表4 各组细胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA相对表达量的比较 （±s）

注 ： ①与Blank 组比较，P <0.05；②与Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组比较，P <0.05。

组别Blank组Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组Si LncRNA FEZF1-AS1-1 组Si LncRNA FEZF1-AS1-2 组Si LncRNA FEZF1-AS1-3 组F 值P 值LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 1.00±0.02 1.08±0.02 0.61±0.03①②0.51±0.03①②0.30±0.02①②183.100 0.000

2.4 沉默LncRNA FEZF1-AS1对细胞增殖的影响

CCK-8 实验结果显示，经析因设计的方差分析，结果显示，Blank 组不同时间点细胞增殖数（OD450）值比较，差异有统计学意义（F=1 733.000，P=0.000）；TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组不同时间点OD450值比较，差异有统计学意义（F=895.400，P=0.000）；TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1组不同时间点OD450值比较，差异有统计学意义（F=1 383.000，P=0.000）。Blank 组、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组及TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1组随时间的变化趋势有差别（F=221.250，P=0.000）。见表5。

表5 各组不同时间点细胞增殖的比较 （±s）

表5 各组不同时间点细胞增殖的比较 （±s）

注 ： ①与0 h 比较，P <0.05； ②与24 h 比较，P <0.05； ③与Blank 组比较，P <0.05； ④与TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组比较，P <0.05。

组别Blank组TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1组F 值P 值0 h 0.24±0.01 0.25±0.008 0.25±0.005 0.932 0.444 24 h 0.62±0.007①0.97±0.03①③0.75±0.02①③④81.100 0.000 48 h 1.09±0.01①②1.54±0.02①②③1.27±0.02①②③④168.700 0.000 F 值1 733.000 895.400 1 383.000 P 值0.000 0.000 0.000

2.5 沉默LncRNA FEZF1-AS1 对细胞迁移的影响

细胞迁移实验结果显示，Blank 组、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组和TGF- β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 组细胞划痕愈合率分别为（27.06±1.64）%、（48.09±1.36）%、（34.31±0.65）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=69.110，P=0.000）。两两比较结果显示，与Blank 组比较，TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组细胞划痕愈合率升高（P<0.05）；与TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组比较，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1组中细胞划痕愈合率降低（P<0.05）。见图2。

图2 各组细胞划痕愈合的检测 （×100）

2.6 沉默LncRNA FEZF1-AS1 对细胞迁移的影响

Transwell 实验结果显示，Blank 组、TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组和TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组迁移细胞数分别为（223.00±3.06）、（325.30±2.91）、（272.70±5.78）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=153.400，P=0.000）。两两比较结果示，TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组迁移细胞数大于Blank 组（P<0.05）；TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组迁移细胞数小于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组（P<0.05）。见图3。

图3 各组细胞迁移的检测 （×100）

2.7 LncRNA FEZF1-AS1基因抑制miR-200c-3p的表达

qRT-PCR 实验结果显示，Blank 组、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组和TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 组细胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 与miR-200c-3p mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组LncRNA FEZF1-AS1 mRNA相对表达量低于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组（P<0.05）；而TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组miR-200c-3p mRNA 相对表达量低于Blank 组（P<0.05）；TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1组miR-200c-3p mRNA 相对表达量高于TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组（P<0.05）。见表6。

表6 各组细胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA、miR-200c-3p mRNA相对表达量比较 （±s）

表6 各组细胞LncRNA FEZF1-AS1 mRNA、miR-200c-3p mRNA相对表达量比较 （±s）

注 ： ①与Blank 组比较，P <0.05； ②与TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组比较，P <0.05。

组别Blank组TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1组F 值P值LncRNA FEZF1-AS1 mRNA 1.29±0.06 5.09±0.12①2.83±0.11①②365.900 0.000 miR-200c-3p mRNA 1.10±0.03 0.15±0.006①0.40±0.003①②1076.000 0.000

2.8 LncRNA FEZF1-AS1 促进肺间质纤维化相关蛋白的表达

Western blotting 检测结果显示，Blank 组、TGFβ1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组和TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。TGF- β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组E-cadherin 蛋白相对表达量高于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组（P<0.05）；TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组N-cadherin 蛋白相对表达量低于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组（P<0.05）；TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 组Vimentin 蛋白相对表达量低于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组（P<0.05）。见图4 和表7。

图4 LncRNA FEZF1-AS1促进肺间质纤维化相关蛋白的表达

表7 各组细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量比较 （±s）

表7 各组细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量比较 （±s）

注 ： ①与Blank组比较，P <0.05； ②与TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组比较，P <0.05。

组别Blank组TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组TGF-β1 + Si LncRNA FEZF1-AS1组F 值P 值E-cadherin蛋白0.87±0.02 0.40±0.01①0.71±0.02①②176.600 0.000 N-cadherin蛋白0.48±0.01 0.87±0.01①0.71±0.01①②266.100 0.000 Vimentin蛋白0.38±0.02 0.87±0.01①0.63±0.03①②112.600 0.000

3 讨论

目前国内外研究认为IPF 发病机制主要与EMT有关，认为肺泡上皮细胞间质转化机制，肺成纤维细胞的活化及胶原沉积等在IPF 发病中具有关键的作用[8]。TGF-β1诱导因子可通过多种不同的信号通路调节EMT，是目前IPF 细胞模型复制中较为成熟的方法。LncRNA 作为人类基因组中重要调节因子，在表观遗传、转录及转录后水平、翻译或翻译后水平调控基因表达，与人类疾病的发生、发展密切相关[4]。研究发现，LncRNA FEZF1-AS1 不仅在各种肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及Warburg 效应中起着至关重要的作用，还参与调节EMT[9]。研究表明抑制LncRNA FEZF1-AS1 可抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭、转移和EMT，发现LncRNA FEZF1-AS1 通过调控前列腺癌中的miR-25-3p/ITGB8 轴促进自噬和EMT[10]。沉默LncRNA FEZF1-AS1 还可抑制非小细胞肺癌NSCLC 的细胞增殖和侵袭，LncRNA FEZF1-AS1 可通过增加E-cadherin 的表达，降低Slug、Twist 和Vimentin 的表达，抑制NSCLC 细胞EMT[11]。研究显示，LncRNA FEZF1-AS1 是肝癌发生、发展中的关键调控因子，沉默LncRNA FEZF1-AS1 基因可通过抑制JAK2/STAT3 信号通路抑制EMT，从而抑制肝癌细胞的侵袭、转移[12]。故目前研究发现LncRNA FEZF1-AS1 在多种肿瘤的EMT 过程中均起着关键作用，但LncRNA FEZF1-AS1 在特发性肺间质纤维化中的作用尚未有报道。本研究首次证实，LncRNA FEZF1-AS1 在特发性肺间质纤维化中明显高表达，LncRNA FEZF1-AS1 在IPF 中促进细胞增殖、迁移、侵袭和EMT 过程，且进一步证实在IPF 中LncRNA FEZF1-AS1 可靶向抑制miR-200c-3p的表达。

本研究EMT 过程中的关键分子选用Ecadherin、N-cadherin 和Vimentin，E-cadherin 是一种Ca2+依赖的、与细胞间黏附密切相关的跨膜糖蛋白，是典型的上皮细胞标志物，E-cadherin 是介导细胞与细胞间黏附的最重要的分子之一，当E-cadherin的表达减少时，细胞间的黏附作用减弱，细胞极性发生改变，导致上皮样细胞进一步向间质样细胞转化。本研究结果也显示，IPF 模型组细胞E-cadherin明显低于对照组细胞，且沉默LncRNA FEZF1-AS1可促进E-cadherin 的表达。而N-cadherin 和Vimentin是间质细胞的重要标志物，N-cadherin 和Vimentin 对维持细胞形态稳定，促进细胞黏附、浸润转移及信号传导均发挥重要作用。本研究结果证实，模型组细胞N-cadherin、Vimentin 表达明显高于空白对照组细胞，敲除LncRNA FEZF1-AS1 基因可抑制Ncadherin、Vimentin 的表达，因此本研究证实LncRNA FEZF1-AS1 在IPF 中促进EMT 的发生。

miR-200c-3p 是目前研究已证实的在IPF 的EMT 发病机制中发挥重要作用调控因子，研究发现miR-200c-3p 在肺间质纤维化患者及动物模型中均显著下调，miR-200c-3p 可抑制肺间质纤维化EMT转化，逆转肺成纤维细胞的纤维原活性[13]。miR-200c-3p 抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞异常的EMT，抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肺泡I 型细胞的转化，进而抑制肺间质纤维化的发生[14]。本研究结果也显示，肺间质纤维化细胞模型中miR-200c-3p 的表达明显低于空白对照组细胞。沉默LncRNA FEZF1-AS1 组细胞中miR-200c-3p 的表达明显高于TGF-β1+ Si LncRNA FEZF1-AS1 NC 组细胞，表明肺间质纤维化中LncRNA FEZF1-AS1 通过靶向抑制miR-200c-3p途径介导疾病EMT 的发生与进展。这也是本研究的创新之处，首次发现IPF 发病机制中LncRNA FEZF1-AS1 对miR-200c-3p 的靶向作用关系。

综上所述，本研究证明LncRNA FEZF1-AS1 通过靶向抑制miR-200c-3p 促进肺间质纤维化细胞增殖、迁移、侵袭和EMT 过程，从而促进肺间质纤维化的发生与进展。本研究对IPF 进展的分子机制有了新的认识，为其治疗提供了潜在的靶点。