一种小鼠原代肝细胞的分离与培养方法

肖勋立，黄聪聪，武利雪，胡慧怡，何学珍，胡立业，喻理德*

(1.井冈山大学附属医院 药剂科，江西 吉安 343000；2.江西中医药大学 药学院，江西 南昌 330004)

肝脏作为人体重要的脏器，在整个物质代谢过程中具有广泛而多样的功能，具有重要的研究价值。[1]肝脏的在体研究成本高，且容易受体内复杂的环境影响，而原代肝细胞的体外模型既能较好的保留肝脏的特异性功能，还可有效地降低研究成本，具有良好的重复性。[2]目前小鼠原代肝细胞的分离方法有多种，其中最经典常用的方法为Seglen 1976年建立的肝脏原位两步灌流法。[3-4]但两步原位灌流法使用、发展至今，依然存在多方面不足导致原代肝细胞分离重复性不高，细胞获得率较低，如小鼠血管较细针管容易扎破，导致灌流失败；灌流速度的把握不当容易造成肝细胞的损伤；灌流过程中的操作不当容易引起细胞污染等，这些因素使得小鼠原代肝细胞无法高效、稳定的获得。[5-7]除了小鼠原代肝细胞的分离问题，更困难的是其体外培养，原代肝细胞分离在体外培养过程中会快速地丧失其正常表型和特异性功能，并且会自发地加速凋亡，发生去分化现象。[8-10]因此，建立一种高效、稳定的小鼠原代肝细胞分离和培养方法具有重要的科研和实际应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料实验动物

6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠，体重约25 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，普通饲料饲养，实验前24 h内禁食。实验主要试剂和仪器：胎牛血清(Gibico)，DMEM(Gibico)，胶原酶Ⅳ(Gibico)，青霉素/链霉素(索莱宝)，ITS-X(Gibico)，HGF(索莱宝)，NaCl(生工)，磷酸氢二钠(生工)，KCl(sigma)，磷酸二氢钾(sigma)，碳酸氢钠(sigma)，EGTA(sigma),葡萄糖(sigma)主要仪器包括:二氧化碳细胞培养箱(Thermo),细胞计数仪(Invitrogen)，倒置显微镜(OLYMPUS)

1.2 方法

1.2.1 试剂的制备

试剂名称成份备注DHanks(1L)NaCl 8g,Na2HPO4 0.05g,KCl 0.4g,KH2PO4 0.06g,NaHCO3 0.35g,葡萄糖1g,用双蒸水定容至1LHBSS(1L)NaCl 8g,Na2HPO4 0.05g,KCl 0.4g,KH2PO4 0.06g,MgSO4 0.098g,CaCl2 0.14g,葡萄糖1g,NaHCO3 0.35g,羟乙基哌嗪乙硫磺酸2.382g,调节PH至7.4,用双蒸水定容至1L培养皿包被液明胶1g,用双蒸水定容至1L0.4%台盼蓝溶液4g台盼蓝,加双蒸水至100mL,用滤纸过滤,4℃保存,使用时,加入PBS稀释至0.4%PBS缓冲液8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl调节溶液的pH值至7.4,加双蒸水定容至1L灌流液0.19 g乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)溶解于1L DHanks溶液中,调节PH至7.4消化液10mg胶原酶Ⅳ溶解于50mL HBSS溶液高压蒸汽灭菌或经0.22um滤膜过滤除菌,4℃保存备用

1.2.2 小鼠原代肝细胞的分离

1.2.3 小鼠原代肝细胞的活率和产量计算

在接种于培养皿前，加入适量体积的培养基重悬，获得合适浓度的细胞悬液，再取少量体积的细胞悬液与0.4 %台盼蓝溶液等体积混合，室温孵育3-5分钟，用细胞计数板对所得小鼠原代肝细胞进行计数，使用移液器将细胞/台盼蓝混合液分别滴加到盖玻片上下两侧边缘，在虹吸的作用下进入盖玻片下的计数池，然后在100倍显微镜下分别对8个大方格进行计数，然后取平均值，最后通过计算得出小鼠肝细胞的活率和产量，计算公式为：细胞活率=无色透明细胞数/总细胞数×100 %，细胞产量=大方格细胞数平均值×2×104×细胞悬液体积。

1.2.4 小鼠原代肝细胞的形态观察

待小鼠原代肝细胞贴壁后，选择不同的时间点，然后移弃培养皿内的培养基，用PBS多次清洗后，加入适量PBS短时间内保持细胞活性，最后在显微镜下观察肝细胞形态，并拍照。

1.2.5 小鼠原代肝细胞的糖原染色

PAS染色又称糖原染色，能够显示糖原和其它多糖物资，可以用来鉴定肝细胞。将培养皿内的原代肝细胞用PBS清洗后，加入95 %乙醇溶液固定，蒸馏水冲洗数次，待干；加入10 g/L的高碘酸溶液氧化10分钟，蒸馏水冲洗数次，待干；加入雪夫染液室温染色30分钟，自来水冲洗3分钟，再蒸馏水冲洗数次，然后用20 g/L甲基绿复染20分钟，自来水冲洗，晾干，最后显微镜观察拍照。

1.3 主要观察指标

通过倒置显微镜观察小鼠原代肝细胞的形态学特征和鉴定结果。

2 结果

2.1 小鼠原代肝细胞的分离和培养

小鼠原代肝细胞分离的具体步骤见方法1.2.1，本研究成功分离获得原代肝细胞(见图1)。

图1 小鼠原代肝细胞的分离

小鼠原代肝细胞的培养是使用含1 %胎牛血清的MCDB11：aMEM按1∶1比例混合，并添加ITS-X和HGF(终浓度10 ng/mL)的完全培养基。并使用提前用明胶包被的培养皿，37℃、5% CO2细胞培养箱培养，细胞在培养4小时后待完全贴壁，弃培养基，用PBS缓冲液清洗掉未贴壁细胞，添加新鲜培养基继续培养，本研究成功的培养原代肝细胞用于后续实验。

2.2 小鼠原代肝细胞的产量和细胞活率

通过细胞计数板计数，每次实验平均每只成年小鼠分离初步获得的原代细胞数量约2×107个。利用台盼蓝染色后，在显微镜下观察发现，几乎所有肝细胞都对台盼蓝拒染，呈现无色透明状，只有零星的几个细胞被染成蓝色，通过细胞计数发现每次分离所获得的小鼠原代细胞的活率均超过95%(见图2)。

图2 台盼蓝拒染检测小鼠原代肝细胞存活率(×100)

2.3 小鼠原代肝细胞的形态学观察

通过倒置显微镜观察发现，分离所得的小鼠原代肝细胞在接种2 h后开始陆续的贴壁生长，此时细胞都呈现圆形或者椭圆形(见图3a)。在肝细胞培养24 h后，肝细胞完全贴壁生长，在显微镜下可见小鼠原代肝细胞呈现不规则形状，有椭圆形，多边形，不规则三角形等，但是细胞界限明晰，胞浆透明，细胞核以单核、双核为主，细胞核清晰可见(见图3b)。在添加了ITS-X和HGF的特殊培养基中培养2W后，小鼠原代肝细胞如铺路石般紧密排列，细胞依然呈不规则状，多边形，类圆形，细胞与细胞之间的界限明确，细胞核有单核、双核，较好地保持了原代肝细胞的形态特征(见图4a)，而对照组的细胞形态发生了改变(见图4b)。

图3a为小鼠原代肝细胞培养2h后(×100)，b为培养24h后(×100)。

图4 小鼠原代肝细胞培养培养2W后(×200)a：实验组，b：对照组

2.4 小鼠原代肝细胞的糖原染色

将小鼠原代肝细胞用PAS染色法染色后，在倒置显微镜下观察发现，肝细胞的胞浆内均可见密集紫红色糖原颗粒，而且视野内几乎所有细胞都被染成紫红色，因此，分离所得肝细胞纯度超过95 %(见图5)。

图5 糖原染色鉴定小鼠原代肝细胞的纯度(×100)

3 讨论

肝脏作为药理学和基础医学等研究的重要靶器官之一，除了在体研究外，目前已经有了多种体外的肝脏模型可供选择，而其中原代肝细胞被认为是肝脏体外试验最为简单、有效的模型。[11]目前，小鼠原代肝细胞的分离方法主要包括：组织块法、胰酶消化法、灌注分离法，其中最被认可的分离方法为肝脏原位两步酶灌流消化法。[12-15]针对肝脏原位两步酶灌流消化法中还存在原代肝细胞产量和活率偏低，细胞容易污染，分离培养成本太高等问题，本研究通过不断实验，找到了相对应的有效解决办法。首先，本研究在实验器械和操作台标准消毒的基础上，通过用75 %酒精给已麻醉的小鼠充分消毒，然后在打开腹腔前将小鼠的皮肤固定在远离腹部的位置，有效地减少了原代肝细胞在分离过程中的污染。其次，在提高原代肝细胞的获得率和存活率方面，本研究通过改变消化液的胶原酶Ⅳ浓度、消化液的灌流速度和时间、细胞的离心速度和时间等，在确定了消化液的胶原酶Ⅳ的浓度为0.2 %，灌流速度为5 mL/分钟，灌流时间为10分钟，细胞分离后选择低速离心，50 g离心5分钟后，主要是通过尽量减少分离过程中对原代细胞的损伤，最终平均每只成年小鼠能够分离得到约2×107个原代肝细胞，并且细胞存活率达95 %以上。由于分离培养成本太高限制了小鼠原代肝细胞的应用，本研究通过优化，将培养基中胎牛血清的浓度由10 %减少至1 %，发现小鼠原代肝细胞依然可以达到良好的贴壁和培养效果，生长速度也无明显差异，这样有效的减少了分离培养过程中的主要成本，更有利于原代肝细胞的推广使用。

原代肝细胞虽然是肝脏研究有效的体外模型，但是其离体培养是一个难题。[15-16]研究发现，原代肝细胞在经过酶的消化变成离体的单细胞后，会自发的加速凋亡，并且会发生去分化现象。[17-19]因此，通过改变培养基成分来提高小鼠原代肝细胞在培养中的成活率和成活时间，是原代肝细胞培养的重要考虑因素。[20-22]本研究在前期干细胞培养研究中受到启发，尝试在小鼠原代培养基中添加ITS-X和HGF两种成分，测试了多种浓度，最终发现添加ITS-X和HGF(终浓度10 ng/mL)可以促使小鼠原代肝细胞有效地延长保持肝细胞的特殊形态和功能的时间。

综上所述，本研究优化了肝脏原位2步酶灌流消化法后，成功建立了一种高效、稳定的小鼠原代肝细胞分离和培养方法，有效的提高了原代肝细胞的获得率和存活率，并延长了原代肝细胞的体外培养时间，为肝脏的体外研究提供了技术支持。