中药调控氧化应激治疗男性不育症实验研究进展

田朝晖 邓润培 曾明月 刘 嘉 杨 超 陶方泽 夏 伟 余琪伟 曾庆琪

(1 恩施土家族苗族自治州中心医院,恩施,445000; 2 南京中医药大学,南京,210029; 3 南京大学,南京,211102; 4 江苏卫生健康职业学院,南京,210029; 5 南京市中医院,南京,210029; 6 南京市江宁医院,南京,210029; 7 昆山市中医医院,昆山,215300)

不孕不育的发病率高达到15%,其中男性不育症(Male Infertility,MI)约占50%[1]。MI不是一种独立疾病,而是由某一种或多种疾病和因素造成的结果,世界卫生组织将MI的影响因素分为17类[2],可见MI的发病机制十分复杂。研究发现,氧化应激(Oxidative Stress,OS)是造成MI的重要原因之一[3]。生理状态下,正常水平的活性氧(Reactive Oxygens Pecies,ROS)对精子的活力、精子获能以及顶体反应发挥积极作用,病理状态下过量的ROS导致OS发生,对男性生育造成不利影响。抗氧化剂作为一种潜在的治疗方案,在改善精液质量方面发挥着重要作用[4]。近年来,广大学者十分关注中药抗氧化研究,报道了许多中药调控OS治疗MI的实验研究。本文对OS与MI的关系,以及单味中药调控OS治疗MI进行综述,以期为中医药治疗MI提供一定的理论依据。

1 OS与MI的关系

1.1 对精子发生的影响

精子发生场所是睾丸,是一个高度复杂的细胞分裂分化过程,需要经历精原细胞增殖分化、精母细胞减数分裂和精子形成3个阶段。精子发生与睾丸间质细胞和支持细胞关系密切,并受到下丘脑-垂体-睾丸轴的调控。过量ROS主要通过以下途径对精子生成造成影响。见图1。

图1 OS对精子生成的影响

1.1.1 对睾丸生精细胞的影响 OS是指机体遭受各种有害刺激时产生过多ROS自由基无法及时清除,导致氧化系统和抗氧化系统平衡失调,引起组织或细胞功能紊乱和损伤的一种状态[5]。生理状态下细胞凋亡是为了维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序地死亡。当OS时,过量ROS使细胞内酶失活而导致细胞凋亡,线粒体是介导细胞凋亡最重要的细胞器,过量ROS可损伤线粒体膜,释放细胞色素C,由此激发半胱氨酸蛋白酶的级联反应,触发了细胞凋亡。研究表明,多种因素可以造成睾丸OS损伤,引起生精细胞凋亡增加,影响精子产生和成熟[6]。

1.1.2 对睾丸间质细胞的影响 睾酮是精子发生的必要条件,间质细胞是合成睾酮的主要细胞。OS可造成线粒体损伤,而线粒体膜上含有睾酮等甾体激素合成的关键酶,线粒体膜结构损伤及膜电位降低可诱导间质细胞凋亡,使睾丸内睾酮浓度降低,而睾酮浓度的降低,又加剧线粒体膜结构和功能损伤,形成正反馈效应,产生更多ROS及更强的OS[6-7]。

1.1.3 对睾丸支持细胞的影响 支持细胞形成血生精小管屏障为生精细胞分化和发育提供微环境,为各级精子细胞提供营养、保护和支持,支持细胞还可以合成并分泌雄激素结合蛋白,并与睾酮、脱氢睾酮具有较强结合力,使生精小管内睾酮浓度增加,为精子发生创造条件。各种病因导致的睾丸OS增强均可损伤支持细胞结构和功能,破坏血生精小管屏障,增加细胞凋亡,影响精子发生[7]。

1.1.4 对睾酮合成的影响 精子发生的复杂生理过程需要睾丸内环境中高浓度睾酮,睾酮主要源于睾丸间质细胞合成,受下丘脑-垂体-睾丸轴负反馈调节。OS导致线粒体受损,线粒体内呼吸链电子转移率降低,可能诱导间质细胞凋亡,加重睾酮缺乏。睾酮水平降低,可伴随抗氧化能力降低。OS损伤加重又可抑制睾酮合成过程中关键酶的活性,引起睾酮水平下降。出现OS损伤加重-睾酮水平降低-睾丸抗氧化能力减弱-OS损伤加重的恶性循环,从而影响睾酮合成,造成精子发生障碍。

1.2 对精子质量的影响

OS对精子质量影响很大,因为精子缺乏胞质抗氧化酶系统而不能对过量ROS造成的损伤及时修复,导致精子极容易受到氧化损伤[8]。过量ROS主要通过以下途径对精子质量造成影响。

1.2.1 对精子膜的损伤 精子膜表面含有大量高浓度多聚不饱和脂肪酸和双键结构,ROS攻击精子膜表面多聚不饱和脂肪酸发生过氧化反应,脂肪酸失去双键,导致精子膜结构受到损伤,缺陷精子数量增加,精子活力减弱,精子获能和顶体受到影响,导致MI[9]。过氧化反应产生的丙二醛(Malonaldehyde,MDA)对精子细胞具有毒性作用,使精子膜通透性增加,完整性受损,胞内调控精子运动能力减弱,导致精子活力下降甚至变为不动精子,因此MDA可反映精子膜的脂类过氧化程度[10]。

1.2.2 对精子DNA的损伤 脱氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)是遗传物质的传递者,当DNA受损后精子质量受到极大影响。过量ROS会损伤精子核DNA的完整性。DNA核酸含有亲核基团,ROS能与其碱基反应使DNA链聚集,改变DNA正常结构,其单链或双链断裂,DNA片段化产生,造成遗传信息改变或缺失[11]。ROS还可通过脂质过氧化作用引起超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)表达变化,从而影响DNA合成,升高DNA碎片化指数(DNA Fragmentation Index,DFI)。DNA受损后产生畸形精子,而畸形的精子又导致更多ROS,从而形成恶性循环,使精子畸形率升高,导致MI[12]。

1.2.3 对精子线粒体的损伤 线粒体是为精子细胞提供能量的场所,其通过糖酵解和氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)为精子细胞活动供应能量。线粒体的结构和功能受到破坏,直接影响精子活力。OS时过量ROS[13]对精子线粒体造成损伤,导致线粒体脱落,数量减少,影响线粒体膜上呼吸链和产生腺苷三磷酸酶系的正常功能,造成线粒体DNA氧化损伤,诱导线粒体内释放钙离子,线粒体内钙离子浓度升高可引起细胞色素氧化酶系统功能失调,导致氧化单电子还原成氧自由基增多,触发细胞凋亡,进而导致精子活力减弱甚至丧失。

1.2.4 对精子运动能力的损伤 研究表明,精液OS指数与精子活率、前向运动率、低渗肿胀率、快速直线运动浓度、快速直线运动总数、直线速度、路径速度、总抗氧化能力和正常形态率负相关[14]。ROS水平与精子的运动能力负相关,可能是ROS引起ATP减少,进而导致精子活力的减弱甚至丧失。

2 中药单体调控OS

2.1 多糖类化合物 研究发现,黄芪多糖、党参多糖、枸杞多糖、黄精多糖、女贞子多糖、石斛多糖、当归多糖、山茱萸多糖属于多糖类化合物,具有抗氧化作用,能改善OS损伤致MI模型的生殖功能[15-22]。见表1。体内实验发现,这些多糖类化合物能提高小鼠睾丸、附睾脏器系数,改善小鼠睾丸精曲小管内径、生精上皮高度,明显增加睾丸曲精小管生精小管内生精细胞数量[15-22]。对性激素的影响主要表现在增加血清睾酮、促黄体生成素、促性腺激素释放激素含量。对抗氧化酶的影响主要表现在升高睾丸组织SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)、总抗氧化能力活性,降低MDA含量。对精子质量的影响主要表现在增加精子数量及密度,增加正常形态精子率,提升精子活力,降低精子畸形率,增加精子顶体反应率。进一步研究发现,枸杞多糖能上调大鼠精子细胞B细胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell Lymphoma-2,Bcl-2)表达,下调Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)表达,提高线粒体膜电位[23]。当归多糖能下调小鼠睾丸组织P53、P21蛋白表达,拮抗致衰剂对睾丸细胞的损伤,其作用机制与抑制p53/p21/pRb信号通路,提高抗氧化能力有关[24]。黄精多糖能上调小鼠睾丸组织磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1(NADPH Quinineoxidoreductase-1,NQO-1)、核因子E2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor 2,Nrf2)、血红素氧化酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)mRNA的表达水平,下调胱天蛋白酶-3(Caspase 3)信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid,mRNA)表达水平明,其机制可能与调控Nrf2和Caspase-3信号通路表达有关[25]。体外实验发现,党参多糖可明显降低体外培养的大鼠睾丸间质细胞SOD和MDA含量,提高GSH-Px活力[26]。女贞子多糖能增加脂多糖诱导的大鼠睾丸支持细胞SOD、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、GSH-Px活性,降MDA浓度,调节支持细胞分泌转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)、白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),减轻炎症反应,降低细胞凋亡,发挥生殖保护作用[27]。

表1 多糖类化合物调控OS改善生殖功能

2.2 黄酮类化合物 黄酮类化合物是一类广泛分布于自然界且具有多样生物活性的天然化合物,由于黄酮类化合物大多呈黄色或淡黄色,且分子中亦多含有酮基,因此被称为黄酮。淫羊藿苷、菟丝子总黄酮、槲皮素属于黄酮类化合物,研究发现[28-36],这些黄酮类化合物具有抗氧化作用,能改善OS损伤致MI模型的生殖功能。见表2。体内实验发现,淫羊藿苷能增强大鼠睾丸附睾指数、精子密度、精子活动率,升高血清睾酮,降低肌酐、尿素氮,增强睾丸组织抗氧化酶活性[28-29]。菟丝子总黄酮能增加大鼠精子数量及活动率,增加睾酮分泌,增强睾丸内酸性磷酸酯酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶活性,降低MDA含量,升高GSH和SOD水平,减少细胞凋亡,其作用机制与下调脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,Fas)和脂肪酸合成酶配体(Fatty Acid Synthase Ligand,FasL)基因表达有关[30]。紫云英苷能恢复小鼠睾丸曲细精管完整性,促使生精细胞排列有序,层次清楚,间质趋于正常,生精细胞及管腔内精子细胞数量恢复正常,修复睾丸组织形态损伤,增强抗氧化酶活性,其作用机制与抑制磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(Phosphorylation c-Jun N-terminal Protein Kainse,p-JNK)表达,减少睾丸细胞凋亡有关[31-32]。槲皮素能增强大鼠睾丸组织抗氧化酶活性,其作用机制与激活Nrf2/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-Like Ech-Associated Protein-1,KEAPl)抗氧化通路有关[33-34]。体外实验发现,淫羊藿苷能增强衰老大鼠睾丸组织初级精母细胞和精原细胞抗氧化酶水平,减轻DNA损伤,其作用机制与激活Nrf2/HO-1信号通路有关[35]。金丝桃苷能增强小鼠精母细胞(GC-2)抗氧化酶活性,抑制细胞凋亡,其作用机制与激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路有关[36]。

表2 黄酮类化合物调控OS改善生殖功能

2.3 皂苷类化合物 皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷。研究发现,人参皂苷Rg1、薯蓣皂苷元、蒺藜皂苷属于皂苷类化合物,具有抗氧化作用,能改善OS损伤MI模型的生殖功能。见表3。体内实验发现,少弱精子症小鼠模型使用薯蓣皂苷元治疗后,勃起潜伏期降低,精子数量及密度提升,睾丸、附睾、脾脏、胸腺的脏器系数增加,精子数目及精子活力增加,睾丸组织中的SOD活性升高,MDA含量降低,说明薯蓣皂苷元能增强睾丸组织的抗氧化能力,减轻OS损伤,对小鼠生殖系统具有保护作用[37]。蒺藜皂苷可提高衰老小鼠附睾精子密度、精子活率、精子活力,降低精子畸形率,增强全血抗氧化酶活性,促进钠泵表达,其作用机制与抗氧化,增加免疫功能,促进损伤细胞修复有关[38-39]。体外实验发现,睾丸间质细胞(TM3)衰老模型,经人参皂苷Rg1干预后,IL-1等炎症介质基因表达下降,GSH-Px和CAT活性升高,MDA与ROS含量降低,睾酮合成关键酶基因及蛋白表达上调,作用机制可能是通过激活Nrf2/抗氧化反应元件(Anti-oxida-tive Response Element,ARE)抗氧化信号通路,调控雄激素分泌功能,对睾丸损伤具有明确的保护作用[40]。体内实验发现,人参皂苷Rg1可以提高实验性精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞Bcl-2的表达,同时下调Caspase-3的表达,抑制生精细胞凋亡,提高睾丸生精功能[41]。

表3 皂苷类化合物调控OS改善生殖功能

2.4 苯丙素类化合物 苯丙素类化合物是指以C6-C3为基本单元的一类化合物。研究发现,姜黄素、五味子甲素、白藜芦醇属于苯丙素类化合物,具有抗氧化作用,能改善OS损伤致MI模型的生殖功能。见表4。体内实验发现,姜黄素能增强大鼠左侧睾丸系数,修复睾丸结构损伤,增大生精小管直径,降低生精细胞凋亡指数,升高血清睾酮水平,增加GSH活力,增强生殖功能[42]。白藜芦醇可降低大鼠睾丸组织MDA水平,升高SOD、GSH水平,影响c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal Protein Kainse,JNK)活性,其作用机制为抑制凋亡信号调节激酶1(Apoptosis Signal-Regulated Kinase-1,ASK1)/JNK/活化转录因子2(Activated Transcription Factor 2,ATF2)信号通路,增强抗氧化能力,减少生精细胞凋亡,保护生精能力[43]。五味子甲素能增加大鼠睾丸系数,升高睾丸组织中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST),升高GSH/氧化型谷胱甘肽(Glutathione Oxidized,GSSG)比值,通过抗氧化作用,保护大鼠睾丸生精功能[44]。体外实验证明,姜黄素可降低人精子悬液ROS含量,增加精子活动率、精子低渗肿胀率,降低精子畸形率,对精子DNA损伤具有一定保护作用,且这种保护作用呈双向性,中剂量时作用最显著,当姜黄素达到一定浓度时,可从抗氧化作用转换成促氧化作用[45]。添加白藜芦醇的冷冻保护剂可以提高小鼠精原干细胞存活数量,降低细胞凋亡率,这种作用可能与其降低ROS水平和Caspase-3的表达有关[46]。

表4 苯丙素类化合物调控OS改善生殖功能

2.5 其他类化合物

研究发现,环烯醚萜苷类化合物(桃叶珊瑚苷)、氮苷类化合物(红景天苷)、苯乙醇苷类化合物(肉苁蓉苯乙醇苷)、低聚糖类化合物(巴戟甲素)、多肽类化合物(牡蛎肽)也具有抗氧化作用,能改善OS损伤致MI模型的生殖功能。见表5。

表5 其他化合物调控OS改善生殖功能

2.5.1 环烯醚萜苷类化合物 桃叶珊瑚苷属于环烯醚萜类化合物[47]。体内实验发现,桃叶珊瑚苷能保持小鼠正常睾丸重量、精子形态、血生精小管屏障完整性,提高GSH活性,降低Bax/Bcl-2比值,降低Caspase-3的裂解和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]的表达,发挥抗氧化作用[48]。此外,桃叶珊瑚苷通过有效抑制蛋白激酶R样内质网激酶(Protein Kinase R-like ER Kinase,PERK)/EBP同源蛋白(C/EBP Homologous Protein,CHOP)和JNK依赖的凋亡途径来抑制细胞凋亡,并通过上调紧密连接蛋白和缝隙连接蛋白表达保护血生精小管屏障的完整性。

2.5.2 氮苷类化合物 红景天苷属于氮苷类化合物。体外实验发现,红景天苷能有效提高大鼠睾丸支持细胞SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量,增加雄激素结合蛋白(Androgen Binding Protein,ABP)和抑制素βB亚基(InhibinβB,INHβB)mRNA表达量,减轻OS造成的睾丸支持细胞损伤[49]。体内实验发现,红景天苷能改善大鼠睾丸细胞结构、生精小管萎缩、生精细胞脱现象,升高睾酮、黄体生成素水平,降低尿促卵泡素水平,升高睾丸组织抗氧化酶活性,降低脂肪酸合成酶、脂肪酸合成酶配体、Caspase-3蛋白表达量,抑制生精细胞凋亡,作用机制与抑制Fas/Fasl信号通路有关[50]。

2.5.3 低聚糖类化合物 巴戟甲素属低聚糖类化合物。用羟基脲构建小鼠肾阳虚模型,经巴戟天主要成分巴戟甲素干预后,首次追逐并射精的时间减少,交配成功率增加,精囊和前列腺的脏器系数增加,精子计数和活力增加,血清睾酮升高,皮质醇降低,睾丸组织中SOD含量升高,GPX、CAT活性增强,MDA活性下降[51]。说明巴戟甲素可以清除ROS自由基,保护精子DNA免受过氧化氢的损伤,抑制细胞膜脂质过氧化反应,修复氧化损伤睾丸的超微结构,对生殖功能发挥保护作用。

2.5.4 苯乙醇苷类化合物 取大鼠精子制备精子悬液,应用FeSO4/H2O2体系产生ROS,应用肉苁蓉苯乙醇苷与精子共同孵育后可提高体外大鼠精子悬液SOD活力,降低MDA含量,抑制精子膜脂质过氧化反应,发挥抗氧化作用,增加精子尾部低渗膨胀率,对精子膜结构和功能具有明显的保护作用[52]。采用共聚焦显微拉曼光谱技术检测发现人精子细胞核拉曼光谱的强度和峰位移发生显著变化,给予肉苁蓉苯乙醇苷保护处理后,这种变化被抑制[53]。肉苁蓉苯乙醇苷能提高精子中SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,对氧化损伤的精子的DNA起到一定的保护作用。

2.5.5 多肽类化合物 牡蛎肽属多肽类化合物。用D-半乳糖诱导大鼠衰老模型经牡蛎肽干预后,能缩短衰老雄鼠捕捉雌鼠潜伏期,增加捕捉次数、射精次数和射精潜伏期[54]。血清锌和睾酮含量升高,可提升血清及睾丸组织SOD、GSH-Px和CAT水平,提升抗氧化能力。还可改善睾丸萎缩症状,修复生精小管上皮结构损伤,促进生精细胞、支持细胞和间质细胞增殖并减少坏死,增加精子数量、精子存活率,降低精子畸形率。说明牡蛎肽对D-半乳糖致衰老雄性大鼠性行为及生殖功能具有改善作用,能在多层次改善生殖衰老状态。

3 小结

综上所述,OS与MI关系密切,OS通过影响生精细胞、间质细胞、支持细胞及睾酮的合成,影响精子发生。通过损伤精子膜、DNA、线粒体,降低精子运动能力,加速细胞凋,使精子质量下降,最终导致MI的发生[55]。单味中药中的有效成分多糖类化合物(黄芪多糖、党参多糖、枸杞多糖、黄精多糖、山茱萸多糖、当归多糖、女贞子多糖、石斛多糖),黄酮类化合物(菟丝子总黄酮、槲皮素、紫云英苷、羊藿苷、金丝桃苷),皂苷类化合物(人参皂苷Rg1、蒺藜皂苷、薯蓣皂苷元),苯丙素类化合物(五味子甲素、姜黄素、白藜芦醇),环烯醚萜苷类化合物(桃叶珊瑚苷),氮苷类化合物(红景天苷),低聚糖类化合物(巴戟甲素),苯乙醇苷类化合物(肉苁蓉苯乙醇苷)多肽类化合物(牡蛎肽)均具有抗氧化作用,可提升雄性动物MI模型的生殖功能。

4 讨论

目前治疗MI的方法主要有药物治疗和非药物治疗,药物治疗包括抗雌激素、雄激素、抗氧化治疗等,常用抗氧化剂包括维生素E、维生素C、辅酶Q10及乙酰半胱氨酸等。MI的主要病机以脏腑虚损为本,湿热瘀滞为标,治疗方面既要补益虚损,充养肾精,提升精液质量;同时又要畅通精室,清热解毒,利湿祛浊,方能生精。黄芪、党参、人参、红景天补气健脾;枸杞子、黄精、女贞子、淫羊藿、菟丝子、山药、杜仲、山茱萸、巴戟天、肉苁蓉补肾填精;石斛、当归、五味子滋阴补血;马齿苋、白蒺藜、姜黄、虎杖、牡蛎清热解毒,行气化瘀;均为临床治疗MI的常用药物。研究表明,这些药物具有抗氧化作用,能改善MI模型的生殖功能,为中医药治疗MI提供了一定的理论支撑,值得进一步深入探讨。中医药调控OS提升生殖功能的研究也还存在一些问题：1)动物实验和细胞实验较多,临床研究较少;2)药效学研究较多,作用机制研究较少;3)没有对MI最终治疗效果指标妊娠率进行观察;4)安全性研究较少。我们应该进一步借助现代科学技术手段,深入研究单味中药在组织细胞和分子基因层次上的作用机制,采用随机双盲对照开展临床研究,全面评估中医药通过调控OS治疗MI的有效性和安全性,为中医药抗氧化治疗MI提供理论支持,进一步推广中医药治疗MI的独特优势。

利益冲突声明：无。