酶辅助提取盐肤木总三萜工艺研究

贾 雯,林 瑶,徐惠龙,许 文,徐 伟

(福建中医药大学药学院,福建 福州 350122)

盐肤木(Rhus chinensis Mill.)是漆树科盐肤木属植物,中医药理论认为其有祛风、化湿、消肿等功效,是中成药舒冠通糖浆、复方满山白糖浆、三七化痔丸等主要原料[1]。课题组前期研究表明,盐肤木除了含有酚酸和黄酮外[1],还发现结构新颖的三萜类成分[2-4],其三萜类成分具有良好的抗心衰和抗血栓等作用,如三萜rhuslactone,显著改善冠心病斑马鱼心脏扩大与静脉窦淤血面积,治疗作用与地高辛相当[2-4],总三萜提取物也可以有效抑制人结直肠腺癌细胞SW620增殖和荷瘤小鼠肿瘤生长,表现良好的抗肿瘤作用[5-7]。但盐肤木中三萜成分含量较低[4],前期开展盐肤木三萜化学分离时发现其提取受到根、茎中木质纤维的影响,提取得率较低,经查阅文献,对于盐肤木三萜类成分的提取工艺研究报道较少。

近年来,酶法已开始用于中药中三萜类成分的辅助提取,尤其针对木质纤维多的药材,如灵芝中的三萜可经纤维素酶水解细胞壁后促进溶出[8],纤维素酶可酶解川木瓜细胞壁中的纤维素,木瓜蛋白酶能够分解川木瓜细胞中游离蛋白,从而提高总三萜得率[9]。纤维素酶能破坏鸡骨草、迷迭香等药材的细胞壁,促进三萜酸成分溶出[10-11]。盐肤木根部有多层韧型木纤维,传统的提取方法有效成分得率低,故本研究进行响应面试验优化酶辅助提取盐肤木总三萜工艺研究,为盐肤木三萜类成分提取开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司,型号:DK-S24);紫外分光光度计(岛津公司,日本,型号:岛津UV-1800);pH计(北京明宸中寰科技有限公司,型号:ST2100/F)。

1.2 对照品及药材

Rhuslactone对照品由实验室自制,经峰面积归一法测定纯度>98%。盐肤木药材经福建中医药大学药用植物学教研室范世明正高级实验师鉴定为盐肤木(Rhus chinensis Mill.)的干燥根。

1.3 试剂

纤维素酶(50 U/mg,批号:A05GS144235);果胶酶(500 U/mg,批号:J12HS173783);半纤维素酶(20 U/mg,批号:S05M10H87186);中性蛋白质酶(100 U/mg,批号:F25HS176360);木瓜蛋白酶(10 U/mg,批号:P10A11B110866)均购买于上海源叶生物科技公司,其他试剂为分析纯。

2 方法和结果

2.1 总三萜标准曲线的建立和含量测定[12]

取rhuslactone对照品,加甲醇制成0.246 mg/mL溶液,作为对照品溶液。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.25、0.35、0.4、0.45 mL分别置于具塞试管中,水浴挥干,加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,60 °C水浴15 min,冰浴冷却至室温,吸取5.0 mL冰醋酸混匀。在最大吸收波长547 nm下测定吸光度值。以吸光度为纵坐标,rhuslactone质量浓度为横坐标,绘制标准曲线:Y=0.0437X+0.0214,r=0.999 5。精密吸取盐肤木提取上清液0.4 mL,水浴挥干,依据标准曲线计算三萜含量。

2.2 酶提取条件的单因素优化

2.2.1 酶的种类选择

称取盐肤木药材5.0 g,置150 mL磨口锥形瓶中,加入16倍量纯水,调节pH 5.0,改变酶的种类(果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶),加入酶3000 U,以无酶组为对照,固定酶解温度为50°C,酶解时间为60 min。酶解处理结束过滤,取滤渣加入20倍量80%乙醇溶液,回流提取2次,每次60 min,合并抽滤液,测定总体积。测定盐肤木提取物总萜量。结果发现经酶处理所得提取物中的三萜提取量高于无酶对照组,其中纤维素酶组提取物中三萜含量最高,因此以纤维素酶提取盐肤木总三萜成分,见图1A。

图1 酶提取法单因素考察结果

2.2.2 酶的添加量优化

称取盐肤木药材5.0 g,加水量同“2.2.1”,调节pH 5.0,加入纤维素酶,改变酶添加量(1000 U、2000 U、3000 U、4000 U、5000 U),固定酶解温度为50°C,酶解时间为60 min。酶解处理结束过滤,同“2.2.1”进行总三萜提取,进行盐肤木提取物总萜量测定。结果发现,当酶的添加量为1000 U～2000 U时,酶添加量与盐肤木提取物总三萜含量成正相关,2000 U酶提取得到的盐肤木提取物总三萜含量最高,当酶用量超过2000 U后,盐肤木提取物总三萜含量逐步降低,见图1B。

2.2.3 酶解酸碱度的优化

称取盐肤木5.0 g,加水量同“2.2.1”,分别调节pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,加入3000 U纤维素酶,45 °C下酶解60 min,酶解处理结束过滤,同“2.2.1”进行总三萜提取,进行盐肤木提取物总萜量测定。结果发现盐肤木提取物三萜化合物的含量随pH的增大而增加,当pH大于5.5后,开始下降,见图1C。

2.2.4 酶解温度的优化

精密称取18份盐肤木粗条5.0 g,加水量同“2.2.1”,调节pH 5.0,加入3000 U纤维素酶,分别在30、35、40、45、50、55 °C下,固定酶解时间为60 min,酶解处理结束过滤,同“2.2.1”进行总三萜提取,进行盐肤木提取物总萜量测定。结果发现,酶解温度介于30℃～45℃时,酶解温度与盐肤木提取物三萜化合物含量成正相关,酶解温度超过 45 ℃后,转变为负相关,见图1D。

2.2.5 酶解时间的优化

称取盐肤木5.0 g,加水量同“2.2.1”,调节pH 5.0,加入3000 U纤维素酶,固定酶解温度为50 ℃,改变酶解时间(30、60、90、120、150 min),酶解处理结束过滤,同“2.2.1”进行总三萜提取,进行盐肤木提取物总萜量测定。结果发现盐肤木提取物总萜量随酶解时间加长而增加,但当酶解时间大于90 min后,趋于平缓,见图1E。

2.3 响应面法优化盐肤木总三萜提取工艺

基于单因素试验,结合响应面法优化盐肤木总三萜的提取工艺。选取酶的添加量、酶解pH值、酶解温度及酶解时间等对盐肤木中总三萜提取存在主要影响的四个因素为变量,盐肤木总三萜提取得率为响应值,考察盐肤木总三萜的最佳提取工艺条件,因素与水平表见表1,方案及结果如表2所示。

表1 因素与水平设计表

表2 中心组合设计及结果(n=3)

对表1数据进行二次回归分析,得方程为:Y=1.17 + 0.030A-0.035B-0.012C-0.048D-9.750E-003AB-0.034AC + 0.023AD + 6.425E-003BC + 0.034BD-2.875E-003CD-0.19A2-0.13B2-0.092χ2-0.035D2,在响应面实验设计中考察的四个因素对盐肤木中三萜化合物的提取得率的响应面三维立体图结果见图2。并对二次回归方程进行方差分析,发现在考察酶提取盐肤木三萜的四个因素中,各因素对总三萜提取量的影响程度大小为酶解时间>酶解pH值>酶的用量>酶解温度,并且四个因素均达到显著水平。并计算模型最优参数为:酶的用量(A)为1 974.83 U、酶解pH值(B)为5.43、酶解温度(C)为45.69 ℃、酶解时间(D)为75.91 min。总三萜得率理论为1.186 %。结合实际操作,调整最佳工艺:酶用量2000 U、酶解pH值5.4、酶解温度45 ℃、酶解时间75 min。

图2 盐肤木中总三萜得率的响应面图

2.4 最佳提取工艺验证

以盐肤木提取物中三萜含量为指标,按照最佳酶解工艺条件验证,试验重复3次,计算得到总三萜平均得率为1.186%,RSD为3.97%,表明实验所建立的二次回归模型预测性良好,优选的提取工艺条件稳定性好,真实性强,工艺稳定可行。

3 讨论

Rhuslactone是盐肤木中含量最高的三萜、盐肤木专属性成分、代表性盐肤木三萜,因此本研究选用rhuslactone作为对照品[4]。在酶提取法的单因素试验中,经酶处理所得提取物中的三萜含量高于无酶对照组,其中纤维素酶提取作用最强,这可能是由于纤维素是细胞壁中最主要的组成成分,因此纤维素酶对细胞壁的水解能力强,而蛋白酶还作用于多糖上的糖蛋白,导致提取液中黏度增加,不利于三萜成分溶出[12]。酶添加量为2000 U时提取效率最高,可能原因是过量的酶会使盐肤木中多糖物质等大分子释放增加,增加提取介质的黏度,阻碍三萜化合物的溶出与扩散,导致得率降低[13]。提取物中的三萜含量,随着pH逐渐变高稳步增加,而pH大于5.5后,提取效率快速下降,原因是不适宜纤维素酶发挥作用的pH,都会降低其活性,从而影响其水解盐肤木细胞壁的能力,致使总三萜提取量降低[12]。45℃后三萜溶出明显减少,原因是当酶解温度高于该酶发挥作用的适宜温度后,酶的活性会降低[14]。随着酶解时间加长,提取物中的三萜含量逐步增加,但时间多于90 min后趋势转为平缓,这是因为酶解时间过短,则酶解过程不充分,酶解时间过长,则酶的活性降低[15]。

综上,在单因素实验基础上,本研究使用响应面法优化酶提取条件,确定了提取工艺中的最优条件:选择纤维素酶进行酶解,添加2000 U(40 mg)纤维素酶,调节pH 5.4,45 ℃下酶解75 min。经验证试验,该工艺合理可行。