枯草芽孢杆菌Y25对龙牙百合生长及其根际土壤微生物群落的影响

涂镜 杨谢斌 魏宝阳 赵鑫 魏林 付威 杨媛茹 汪洪鹰 易永健 曾粮斌

涂 镜，杨谢斌，魏宝阳，等. 枯草芽孢杆菌Y25对龙牙百合生长及其根际土壤微生物群落的影响 ［J］. 江苏农业科学，2024，52（7）：214-223.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.029

（1.中国农业科学院麻類研究所，湖南长沙410205； 2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410125； 3.湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南长沙410125； 4.湖南省岳阳市岳阳县植保植检站，湖南长沙414100）

摘要：为明确芽孢杆菌Y25灌根对百合连作根际土壤微生物群落结构的影响，为减轻百合连作障碍提供技术和理论依据。以湖南省邵阳市隆回县百合种植基地连作3年以上进行3种不同处理，不种植百合空白处理（BG）；种植百合但不用菌剂灌根处理（CK）；种植百合且用Y25菌剂灌根处理（Y25）。探究3种不同处理对土壤理化性质和微生物群落结构的影响，同时对百合进行病情调查，统计分析不灌根与灌根处理对百合病情和生长的影响。与对照组（CK）相比，芽孢杆菌灌根处理后龙牙百合的株高、茎粗、鲜重以及产量均有提高，且百合枯萎病防治效果高达65.86%。此外，根际土壤中总磷、铵态氮、硝态氮、速效钾、速效磷、有机磷含量均显著增加。PCoA结果显示，施用芽孢杆菌后细菌群落结构发生显著变化，而真菌群落结构未发生显著变化。Y25菌剂灌根处理后根际土壤微生物的相对丰度也发生变化，其中拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门的相对丰度提高，疣微菌门、壶菌门相对丰度显著降低，γ-变形菌纲（未确定）以及芽孢杆菌属的相对丰度显著增加。枯草芽孢杆菌Y25可以改善土壤理化性质，使得根际土壤有益微生物的相对丰度增加，进而促进龙牙百合生长及有效防治病害。

关键词：枯草芽孢杆菌；龙牙百合；防病；促生长；微生物群落结构

中图分类号：S682.2+65.06；S182  文献标志码：A  文章编号：1002-1302（2024）07-0214-09

百合（Lilium brownii）隶属于百合科（Liliaceae）、百合属（Lilium），是重要的球根花卉之一［1］。龙牙百合（Lilium brownii var. viridulum）鳞茎富含碳水化合物、蛋白质和果胶等营养物质，是我国三大食用百合栽培品种之一［2］。除了食用价值外，龙牙百合以其鳞茎入药，具有润肺止咳、清热、安神和利尿等较高的药用价值［3］。然而为了追求良好的经济效益，龙牙百合种植面积不断扩大，发病率也随之增高，其中致病镰刀菌引发的百合枯萎病（茎腐病）病害最严重，致使百合品质下降严重［4-5］。探究生防芽孢杆菌Y25对百合连作发病的控制及其根际土壤微生物群落结构的影响，有利于明确枯草芽孢杆菌对减轻百合连作障碍的作用及其机制。已有多项研究表明，外源细菌引入土壤后，可以通过在植物根际定植来影响土壤菌种的组成，从而改变根际土壤微生物的群落结构［6-9］。而芽孢杆菌作为一种生防制剂，不仅对多种植物病害具有良好的防治效果，还能对植物产生促生、固氮和抗逆境等作用［10］。有研究表明，巨大芽孢杆菌对烟草具有良好的促生效果，可以提高烟草的品质，并对烟草土壤微生物群落结构产生显著影响；枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌的抑制率分别为81.38%、77.53%；以枯草芽孢杆菌B908为主要有效成分的微生物农药“百抗”，在大田应用中对水稻纹枯病的防效率超过70%［11-13］。枯草芽孢杆菌对缓解百合连作障碍的作用及机制还未明确。在连作3年的百合种植基地进行枯草芽孢杆菌Y25灌根处理，明确灌根处理对连作土壤理化性质的影响；同时通过病情调查统计芽孢杆菌灌根与不灌根处理对百合生长的影响，并采用高通量测序技术明确生防菌Y25对百合连作土壤微生物群落结构的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试百合品种为龙牙百合。所使用菌剂为枯草芽孢杆菌Y25（Bacillus subtilis Y25），由笔者所在课题组从根际土壤样品中分离筛选得到，有效活菌数为1×108 CFU/mL［14］。

1.2 试验设计及样品采集

试验时间为2019年3月，试验地点为湖南省隆回县百合种植基地。该基地已连续3年种植龙牙百合，每年发病率在50%以上。试验设3个处理，每个处理重复4次，每个重复面积为 27 m2，具体处理如下：不种植百合（BG）；种植百合但不进行灌根处理（CK）；种植百合，且每株灌根约40 mL浓度为 [JP2]1×108 CFU/mL的枯草芽孢杆菌Y25发酵液（Y25）。其他农事活动同常规处理，1周后进行第2次灌根。

在每个重复中，采用五点取样法，每点取6株百合，对这30株百合进行枯萎病病情调查（第2次灌根处理后4周）。采用同样的方法对30株百合的株高、茎粗、鲜重等生长指标进行测量。每个重复采用同样的五点取样法，每个点取2株百合，在抖落大块土壤后用刷子仔细收集10株百合根部周围的根际土壤（第2次灌溉处理后70 d）。将采集好的土样做好标记并封好拿回实验室保存。将筛除杂质后的土壤分为2份，一份保藏于-80  ℃冰箱，用于DNA提取，另一份风干后用于测定龙牙百合根际土壤的理化性质。

1.3 龙牙百合生长指标及根际土壤理化性质测定

在试验处理70 d后，对龙牙百合鳞茎进行病情调查。根据鳞茎腐烂程度分为6个级别：0级，没有；1级，腐烂面积为1%～20%；3级，腐烂面积为21%～40%；5级，腐烂面积为40%～60%以上；7级，腐烂面积为61%～80%；9级，腐烂面积为81%～100%，并分别测定龙牙百合的株高、茎粗、鳞茎鲜重和产量。

土壤理化性质：pH值、总氮含量（g/kg）、总钾含量（%）、有机质含量（g/kg）、总磷含量（mg/kg）、铵态氮含量（mg/kg）、硝态氮含量（mg/kg）、速效钾含量（mg/kg）、有机磷含量（mg/kg）、速效磷含量（mg/kg）等的测定方法参照上海茁彩生物科技有限公司相应试剂盒说明书。

1.4 龙牙百合根际土壤微生物总DNA提取和PCR扩增

龙牙百合根际土壤样品的总DNA采用十六烷基溴化铵法（CTAB法）进行提取和纯化后，分别对细菌16S rRNA基因的V3～V4区段用引物515F和806R进行PCR扩增和序列测定，对真菌18S rRNA基因的ITS1區段则用引物ITS5-1737F和ITS2-2043R进行PCR扩增和序列测定［15］。

1.5 高通量测序数据处理

用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测和纯化，并使用GeneJET胶回收试剂盒回收产物（thermo fisher scientific，美国），剪切回收目标条带，然后将DNA样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序。

1.6 统计与分析

使用软件R（4.2.1）的WGCNA、Stats和 Ggplot 2 程辑包对采集的样品进行主坐标分析，使用R中的VEGAN程辑包对样品的微生物群落及土壤理化性质关系进行冗余分析，并用Ggplot 2进行可视化。结合R软件绘制土壤微生物中细菌、真菌的相对丰度图，对不同处理间百合的根际土壤理化性质、微生物α多样性指数以及物种组成结构差异性使用SPSS 26.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 Y25菌剂灌根对龙牙百合生长的影响

由表1可知，Y25菌剂灌根对龙牙百合有明显的促生作用。相较于CK，Y25灌根的龙牙百合株高增长35.23%，茎粗增长42.38%，鲜重增长221.17%。百合鳞茎产量增长26.02%，且Y25灌根处理对龙牙百合的防治率为65.86%。

2.2 龙牙百合根际土壤理化性质

根际土壤理化性质测定结果（表2）显示，与空白组BG对比，CK对照组的总磷、铵态氮、硝态氮、有机磷等的含量均显著降低（P<0.05），而其他理化性质的变化未达显著水平。经过枯草芽孢杆菌Y25灌根后，百合根际土壤的总磷、铵态氮、硝态氮、速效钾、速效磷、有机磷含量均显著增加，相比CK分别提高92.69%、121.70%、25.82%、27.71%、66.87%、122.45%，而pH值、总氮、总钾、有机质含量的改变未达显著水平。

2.3 土壤细菌群落结构比较

从百合根际土壤细菌群落主坐标分析可以观察到枯草芽孢杆菌Y25处理组的4次重复在坐标轴上与BG、CK处理均显著分离（图1-a），说明Y25灌根处理对细菌微生物群落结构影响明显。进一步分析发现坐标轴1和坐标轴2分别解释所有变量的40.16%、16.34%，2个主成分方差贡献率累计达56.50%。属水平上的物种聚类热图（图1-b）显示[JP]，BG、CK、Y25等3个不同处理组的4次重复均能分别聚类在一起，在热图中同样能明显看出，Y25处

理组的芽孢杆菌属的相对丰度明显高于BG组和CK组。在97%分类水平下，对龙牙百合根际土壤的细菌多样性进行α多样性分析，结果（表3）显示，与BG空白组相比较，CK组的Shannon指数显著增加，而与对照组CK相比较，Y25处理组的Richness、ACE以及Chao1指数均显著增加。

门水平上不同处理根际土壤细菌群落组成结果（图2-a）表明，3种不同处理前10个丰度较高的菌群分别为变形菌门（26.41%～52.64%）、酸杆菌门（15.25%～35.00%）、拟杆菌门（0.75%～6.50%）、绿弯菌门（5.18%～17.58%）、放线菌门（4.01%～12.35%）、芽单胞菌门（0.52%～6.04%）、硝化螺旋菌门（0.47%～2.53%）、疣微菌门（0.42%～3.69%）、厚壁菌门（0.28%～2.42%）、未确定细菌门（0.41%～1.72%）。与空白组BG进行比较，CK组芽单胞菌门、疣微菌门相对丰度显著增加；与CK对照组进行比较，使用Y25灌根处理后疣微菌门的相对丰度显著降低（表4）。

属水平上不同处理根际土壤细菌群落组成结果（图2-b）表明，3种处理的前10个丰度较高的菌群分别为朱氏杆菌属（0.23%～34.30%）、Brvobacter（1.99%～15.05%）、伯克霍尔德菌属（未确定）（0.14%～8.84%）、Candidatus_Solibacter（0.82%～3.29%）、鞘脂单胞菌属（0.61%～3.97%）、芽单胞菌属（0.23%～4.28%）、Haliangium（0.23%～4.07%）、酸杆菌属（0.68%～3.48%）、酸微菌属（未确定）（0.62%～2.40%）、γ-变形菌纲（未确定）（0.40%～1.89%）。[JP]其中与空白组BG进行比较，CK组Candidatus_Solibacter、鞘脂单胞菌属、芽单胞菌属相对丰度显著增加；与CK对照组进行比较，使用Y25灌根处理后γ-变形菌纲（未确定）相对丰度显著增加（表5）。值得注意的是Y25灌根处理后根际土壤中芽孢杆菌属的相对丰[JP+1]度显著增加（图3），说明Y25灌根处理后在百合根际土壤中具有良好的定殖能力。

2.4 土壤真菌群落结构比较

由龙牙百合根际土壤真菌群落主坐标分析（图4-a）可知，3种不同处理在坐标轴上未显著分离。进一步分析发现，坐标轴1和坐标轴2分别可以解释变量的20.65%、15.89%，2个主成分方差贡献率累计为36.54%。属水平上的物种聚类热图（图4-b）显示，BG、CK、Y25等3个不同处理组的4次重复未能分别聚类，且在热图中能明显看出，CK、Y25处理组镰刀菌属的相对丰度低于BG组，但由图3可知，3种不同处理镰刀菌属的相对丰度差异并不显著。在97%分类水平下，对龙牙百合根际土壤的真菌多样性进行α多样性分析（表6），发现与BG空白组相比较，CK组的α多样性指数未有显著变化，且与对照组CK相比较，Y25处理组的α多样性指数也未有显著变化。

由门水平不同处理根际土壤真菌群落组成结果（图5-a）可知，3种处理共包含12个菌门，分别为子囊菌门（22.90%～57.51%）、担子菌门（2.35%～28.86%）、罗兹菌门（0.16%～7.55%）、被孢霉门（0.30%～3.88%）、壶菌门（0.09%～3.94%）、球囊菌门（0.00%～0.32%）、梳霉门（0.00%～0.21%）、毛霉亚门（0.00%～0.66%）、单毛壶菌门（0.00%～0.04%）、油壶菌门（0.00%～0.08%）、捕虫霉门（0.00%～0.03%）、虫霉门（0.00%～0.01%）。与空白组BG进行比较，CK组壶菌门相对丰度显著增加；与CK对照组进行比较，使用Y25灌根处理后壶菌门相对丰度显著降低（表7）。

在属水平上，由不同处理条件下龙牙百合根际土壤群落组成结构（图5-b）可知，相对丰度排名前10的菌群分别为镰刀菌属（1.26%～9.36%）、Vanrija（0.00%～17.33%）、炭疽菌属（0.59%～[JP]16.16%）、Humicola（0.67%～9.94%）、枝孢属（0.02%～11.54%）、产油菌属（0.61%～5.45%）、蛇形虫草属（0.01%～9.53%）、裸伞属（0.01%～9.21%）、青霉属（0.06%～2.62%）、Saitozyma（0.35%～2.33%）。3种不同处理组之间在真菌属水平上均无显著差异（表8）。

2.5 龙牙百合根际土壤微生物优势菌属与土壤理化因子的RDA分析

对10种土壤理化因子与3组土壤样品微生物群落多样性的关系进行冗余分析，发现土壤的10个理化指标对3组土壤中细菌群落多样性的影响从大到小排序为速效钾含量＞铵态氮含量＞速效磷含量＞有机磷含量＞pH值＞有机质含量＞硝态氮含量＞总磷含量＞总钾含量＞总氮含量（图6-a）。其中芽孢杆菌属与速效钾、铵态氮、速效磷、有机磷含量4个元素成正相关，与其他元素成负相关。土壤的10个理化指标对3组土壤中真菌群落多样性的影响从大到小排序为pH值＞硝态氮含量＞总氮含量＞总钾含量＞有机质含量＞速效钾含量＞铵态氮含量＞总磷含量＞速效磷含量＞有机磷含量（图6-b）。其中镰刀菌属与pH值、硝态氮、铵态氮、总磷、有机磷含量5个元素成正相关，与其他元素成负相关。

3 讨论

3.1 百合生长对芽孢杆菌Y25灌根的响应

对作物应用生防菌剂灌根，以防治作物病害的发生以及提高土壤养分利用效率是现代农业的研究热点之一。国内外多项研究结果表明，芽孢杆菌在防治植物病害和提高产量方面具有良好的作用及明显的效果，且对土壤环境污染也具有良好的修复效果，如刘杉等从土壤中筛选得到1株短小芽孢杆菌Y106，可用于棉花黄萎病的生物防治［16］； Tian等认为，解淀粉芽孢杆菌TB6能促进人参根系生长，增加人参根系鲜重［17］； 多黏类芽孢杆菌CH-23发酵菌剂对水稻恶苗病的生防指数高达68.35%［18］ ；邓振山等认为，1株蜡状芽孢杆菌具有较强的降解石油的能力，且在生物强化处理中，以混合营养物为底物时降解率可以达到90.23%［19］。本研究利用芽孢杆菌Y25灌根处理，探究Y25对龙牙百合生长及枯萎病的防治效果。由表1可知，芽孢杆菌Y25灌根处理对龙牙百合枯萎病生防效率高达65.86%，且对百合生长具有明显的促生长效果，与CK相比，芽孢杆菌灌根处理，百合株高增长35.23%，茎粗增长42.38%，鲜重增长221.17%。百合鳞茎的产量为17 070 kg/hm2，相比CK增加26.02%，这与刘涛等的研究结果［20-21］基本一致。

3.2 土壤微生物多样性及群落结构

已有研究表明，芽孢杆菌可以通过在土壤中定殖影响土壤中的优势菌群，从而使土壤微生物群落发生改变［6］。本研究从α多样性指数结果来看，种植百合能显著提高根际土壤细菌的多样性，而真菌的多样性并无显著变化；用芽孢杆菌Y25灌根处理后，百合根际土壤细菌的丰富度和多样性均显著增加，但真菌多样性和丰富度无明显变化，这与黄亚丽等的研究结果［22］一致。细菌主成分分析结果也显示，Y25组与BG、CK组在坐标轴上分开，但真菌主成分分析结果显示，3种不同处理在坐标轴上未显著分开，说明Y25处理导致细菌群落结构发生变化，但对真菌群落结构没有明显影响。

进一步分析枯草芽孢杆菌Y25对龙牙百合根际土壤微生物群落组成的影响。龙牙百合根际土壤细菌的优势菌门主要有变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门，这与张红霞等关于山药、玉米、油用凤丹牡丹等细菌群落的研究结果相同，说明土壤细菌群落结构本身具有一定的稳定性［23-25］。本研究用芽孢杆菌Y25灌根处理后，土壤中拟杆菌门、绿弯菌门以及放线菌门的相对丰度增加，而研究结果表明，拟杆菌门是富营养菌，具有溶磷作用，绿弯菌门细菌倾向于在营养条件充足的环境中生存，营养元素有利于绿弯菌门的繁殖，土壤养分供给的主要来源之一为放线菌门，且放线菌门能通过分泌各种抗生素来抑制土壤中的病原微生物［26-29］。在属水平上，种植龙牙百合后，芽单胞菌门、疣微菌门相对丰度显著增加，而使用Y25灌根处理后疣微菌门相对丰度降低至未种植龙牙百合时的水平，而芽孢杆菌相对丰度得到显著增加。隶属于芽单胞菌门的芽单胞菌属经研究发现具有减缓重金属和抗生素复合污染的作用［30］。芽孢杆菌属隶属硬壁菌门，絕大多数的芽孢杆菌属细菌都是有益菌，因而可以推测施用枯草芽孢杆菌Y25使土壤中有益微生物数量增加，从而对百合枯萎病有良好的抑制效果。与之前研究结果相似的是龙牙百合根际土壤真菌的优势菌门主要有子囊菌门、被孢霉门、担子菌门、壶菌门、罗兹菌门［31］。在种植龙牙百合后，壶菌门的相对丰度显著增加，而枯草芽孢杆菌灌根处理后壶菌门的相对丰度显著降低，在属水平上，使用芽孢杆菌灌根对龙牙百合根际土壤真菌并无显著影响。这与黄亚丽等的研究结果一致，即枯草芽孢杆菌菌剂灌根处理仅对壶菌门的丰度影响显著，而对甜瓜土壤中其他真菌菌群的多样性影响较小［22］。

3.3 土壤性质对芽孢杆菌Y25灌根的响应

土壤理化性质是影响土壤微生物群落结构的重要因素之一。国外学者发现土壤水分是影响加拿大西部7个生物气候区微生物群落结构和酶活性的主要因素［32］；姜小凤等认为，当归根际土壤中变形菌门的相对丰度与土壤pH值、有机质含量、碱解氮含量、电导率、有效磷含量、速效钾含量呈负相关［33］；Brockett等认为，土壤pH值、速效磷含量和全氮含量是影响当归土壤细菌优势属的主要因素，而土壤pH值、全氮含量、电导率均是影响当归土壤优势菌门的主要因素［32-34］。本研究发现，种植龙牙百合后，土壤中总磷、铵态氮、硝态氮、有机磷等的含量显著降低，而施用芽孢杆菌Y25菌剂后，土壤中总磷、铵态氮、硝态氮、速效钾、速效磷、有机磷含量显著增加，可能是因为种植龙牙百合后，百合吸收利用土壤中的养分，从而导致一些理化含量降低，而施用芽孢杆菌后，土壤中理化性质得到改善，一些理化性质含量又恢复到甚至超过未种植百合时的水平，该结果也与Zhao等发现，施用烟草秆生物炭后，白及土壤pH值、电导率、有效氮含量、有效磷含量、有效钾含量显著增加，且细菌群落结构发生改变的结论［35］一致，上述研究结果均说明外源菌剂或其他物质的施用也能显著改善土壤的理化性质，进而引起微生物群落结构的改变。龙牙百合土壤真菌和细菌优势菌属与土壤理化性质的冗余分析结果表明，细菌优势菌门与土壤速效钾、铵态氮、速效磷含量相关性较高，而真菌优势菌属与pH值、铵态氮含量、总氮含量相关性较高。芽孢杆菌属与速效钾、铵态氮、速效磷、有机磷含量等4个因素成正相关。

4 结论

本研究采用高通量测序技术并对土壤理化性质进行测定，综合分析枯草芽孢杆菌Y25菌剂灌根处理对龙牙百合土壤微生物群落结构的影响及其生防效果，发现枯草芽孢杆菌Y25对百合鳞茎枯萎病的防病率高达65.86%，龙牙百合的株高、茎粗、鲜重显著增加，且产量大幅提高，对百合具有良好的防病及促生长效果。龙牙百合经芽孢杆菌灌根处理后，百合根际土壤中的总磷、铵态氮、硝态氮、速效钾、速效磷、有机磷等含量均有显著提高，百合根际土壤微生物群落结构也发生了相应变化，其中拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门群落的相对丰度提高，疣微菌门、壶菌门群落的相对丰度显著降低，芽孢杆菌属的相对丰度也显著增加。综上，龙牙百合经枯草芽孢杆菌Y25灌根处理后，土壤微生物多样性明显增加，使土壤理化性质得到改善，土壤中有益微生物群落相对丰度明显增多，从而可以有效防止百合枯萎病的发生，为枯草芽孢杆菌菌剂在农业中的应用提供一定的理论指导。

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基金项目：湖南省重点研发计划（编号：2021NK2003）；中国农业科学院农业科技创新工程项目（编号：CAAS-ASTIP-IBFC08）。

作者简介：涂 镜（2000—），女，湖南常德人，硕士研究生，主要从事百合枯萎病防治以及根际土壤微生物分析研究。E-mail：2096793079@stu.hunau.edu.cn。

通信作者：曾粮斌，博士，副研究员，主要从事经济作物生物防治和植物免疫诱抗研究。E-mail：zengliangbin@ caas.cn。