养殖池塘丝状藻发生关键因子调查

唐永涛， 汪 晨,， 成永旭， 孙云飞，赵良杰， 钱 晨， 杨颖飞

(1. 上海海洋大学，农业农村部稻渔综合种养生态重点实验室，上海 201306；2. 信阳农林学院水产学院，河南 信阳 464000；3. 山东景明海洋科技有限公司，山东 东营 257000)

丝状藻广泛存在于各种养殖及自然水体，不但影响了景观、环境，而且死亡后腐烂产生有毒有害气体也会对养殖动物或自然水域生物多样性构成威胁[1-4]。尤其在虾蟹养殖中，丝状藻暴发不但抑制水草的生长，而且会缠绕虾蟹引起死亡[5]，由于目前还没有安全有效的控制手段，养殖户多选择市面上流行的杀丝状藻药，而这些杀丝状藻药多筛选自农用除草剂，存在较大的安全隐患，每年都出现一些养殖户因杀丝状藻而造成养殖损失的案例。

在丝状藻生态学研究中，关于丝状藻发生诱因的观点很多，如基质[6]、水流[7]、光照[8]、温度[9]、营养盐[10]及休眠孢子[11]等。笔者曾大量走访江苏、安徽的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)池塘，发现在一些隶属于同一家养殖户的池塘，其环境、水源、池塘情况均基本相同，却出现丝状藻发生有无的差异现象。鉴于以上情况，基质、水流、温度、光照的因素基本可以排除。事实上，关于丝状藻的发生，多数的观点认为水体氮磷等营养盐的增加是主要原因[12-14]。实施磷减排或控制溶解性磷措施后，安大略湖和Windermere 流域刚毛藻生物量分别降低60%[15]和90%[16]。但是，1995—2006 年，五大湖下游地区再次暴发刚毛藻水华[17]，但事实上，这个时期五大湖的近岸水域并没有检测到水体总磷水平有增加趋势[10]。由此可见，决定刚毛藻生物量高低的因素可能不仅限于营养盐的多寡。许多丝状藻类能形成孢子和配子，也即有世代交替现象[18-19]，而且配子或孢子在冬天或春天发生较多[18,20]。但是，目前有关外源带入丝状藻繁殖体引起丝状藻发生多停留在理论推测层面，而证实这种关系的研究还很少。基于以上原因，实验针对性地选择了同一家养殖户、同一片养殖区域的有丝状藻塘和无丝状藻塘，重点从营养盐、丝状藻繁殖体和人为操作三个方面进行对比研究，以期找出导致丝状藻发生的关键因素，为后续防控研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验设计

2019 年3 月5 号，选择中华绒螯蟹养殖初期，在常州市金坛区，按照同一家养殖户、同一块区域位置邻近、环境条件基本相同的原则，筛选出5 组有丝状藻塘和无丝状藻塘，编号1～5 组，其中有丝状藻塘依次编号为1-1、2-1、3-1、4-1、5-1，对应的无丝状藻塘依次编号为1-2、2-2、3-2、4-2、5-2，对应的水源依次编号为1-3、2-3、3-3、4-3、5-3。重点对比每组有丝状藻塘、无丝状藻塘和水源的水体、底泥营养盐水平、丝状藻繁殖体数量和人为操作三个方面。

1.2 样品采集

每个池塘及水源按照中间位置和左右两边的位置共设3 个采样点，采集中层水样和表层10 cm 泥样，采集好的样品放于冰盒中并快速带回实验室处理。

1.3 样品测定与分析

水质测定 pH 现场测定，根据《水和废水监测与分析方法》第4 版，采回的水样用碱性过硫酸钾消解，紫外分光光度法测定总氮(TN)，采用钼酸铵分光光度法测定总磷(TP)。按照《水质 叶绿素a的测定 分光光度法》(HJ 897-2017)测定叶绿素a(Chl.a)含量。水样经过0.45 μm 滤膜抽滤，滤膜经10 mL 90%丙酮4℃避光萃取12 h后(每4 h 摇匀1 次)，依次测定750、664、647、630 nm波长下的吸光度值，然后计算Chl.a的含量。

底泥生物可利用性氮磷测定 底泥放于玻璃培养皿中在室内通风自然晾干，充分研磨成粉末后，每个样称取20.0 g 放于自封袋中，寄送到苏州梦犀生物医药科技有限公司进行生物可利用性氮含量和生物可利用性磷含量的测定。底泥生物可利用性氮的测定方法：取风干土2.0 g 于扩散皿中，采用碱性溶液水解土壤，释放出的NH3经硼酸吸收后，再用标准酸滴定，然后计算土壤中速效氮的含量。底泥生物可利用性磷的测定方法：称取0.05 g 研磨过筛的土样，用弱碱性提取碱溶性磷和吸附态磷，后用钼锑抗比色法测定。

丝状藻繁殖体检测 每个底泥样品取约10 g，用离心管盛装，冻存-30 ℃。取250 mL 水样，用0.45 μm 滤膜抽滤后，将滤膜于-30 ℃冻存，并与泥样一起用干冰冷冻寄送至上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA 提取及后续繁殖体检测(所用引物为，双正向引物：A23SrVF1：GGACARAAAGACCCTATG，A23SrVF2：CARAAA GACCCTATGMAGCT 和双逆向引物A23SrVR1：AGATCAGCCTGTTATCC，A23SrVR2：TCAGCC TGTTATCCCTAG)。重点关注丝状藻的主要组成种，即水绵(Spirogyra)和刚毛藻(Cladophora)。

1.4 数据分析

采用Excel 2010 软件进行数据的初步处理，用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析。P＜0.05认为有显著差异。

2 结果

对比5 组有丝状藻塘和无丝状藻塘发现，组1 无丝状藻塘采用约1 500 kg/hm2的生石灰进行了清塘，且早春初次进水为深井水，而有丝状藻塘则未清塘(表1)。组2 中，有无丝状藻池塘均采用约150 kg/hm2的漂白粉进行了清塘，其余操作也基本相同，不同的是有丝状藻塘在养殖初期从外源引进伊乐藻，暴发丝状藻后又泼洒了硫酸铜(3.75 kg/hm2)，但丝状藻并没有得到明显控制，而无丝状藻塘未从外源引入伊乐藻。组3 中，无丝状藻塘采用约225 kg/hm2的漂白粉进行了清塘，而有丝状藻塘未清塘，其余管理措施均相同。组4 中，无丝状藻塘进行了长时间的晒塘，并且在进水时采用了氨基酸肥水，而有丝状藻塘晒塘时间比无丝状藻塘短了20 d，且没有肥水措施，其余操作相同。组5 中，有无丝状藻塘管理操作均相同。

表1 调查池塘的重要管理操作记录Tab. 1 Records of important management operations in the ponds investigated

各池塘水体及水源氮磷浓度对比如表2 所示，组1、组3 和组5 共三组有丝状藻塘pH 值显著高于无丝状藻塘和水源(P＜0.05)，组2 有丝状藻塘与无丝状藻塘之间无显著差异(P＞0.05)，组4 无丝状藻塘显著高于有丝状藻塘(P＜0.05)。对于TN含量，组2 和组4 有丝状藻塘显著高于无丝状藻塘和水源(P＜0.05)，组1 和组5 无丝状藻塘显著高于有丝状藻塘(P＜0.05)，组3 则三组之间无显著差异(P＞0.05)。对于TP 含量，组1、组3、组4和组5 四组的有丝状藻塘、无丝状藻塘和水源之间均无显著差异(P＜0.05)，仅组2 的无丝状藻塘显著高于有丝状藻塘和水源(P＜0.05)。对于Chl.a含量，组1、组2、组3 和组4 这四组的无丝状藻塘均显著高于有丝状藻塘(P＜0.05)。

表2 不同池塘及水源水化学指标Tab. 2 Water chemical indexes of different ponds and water sources

5 组有丝状藻塘的生物可利用性氮含量为9.58～23.57 mg/kg，平均为(15.72±3.60) mg/kg；5组无丝状藻塘的生物可利用性氮含量为9.63～15.40 mg/kg，平均为(13.22±1.97) mg/kg；5 组水源的生物可利用性氮含量为3.85～20.13 mg/kg，平均为(9.47±2.97) mg/kg (图1)。5 组有丝状藻塘平均可利用氮含量较无丝状藻塘高2.50 mg/kg。组1 中有丝状藻塘、无丝状藻塘及水源之间生物可利用性氮含量无显著差异(P＞0.05)。组2、组3 中，有丝状藻塘与无丝状藻塘之间生物可利用性氮含量均无显著差异(P＞0.05)，且二者均显著高于水源生物可利用性氮含量(P＜0.05)。组4 中，有丝状藻塘生物可利用性氮含量显著高于无丝状藻塘(P＜0.05)，而无丝状藻塘显著高于水源(P＜0.05)。组5 中，有丝状藻塘与无丝状藻塘之间生物可利用性氮含量无显著差异(P＞0.05)，而无丝状藻塘显著高于水源(P＜0.05)。

图1 5 组池塘各底泥样本的生物可利用性氮含量图中不同字母代表组内差异显著(P＜0.05)，下同。Fig. 1 Bioavailable nitrogen content of sediment samples from 5 groups of ponds In the figure, different letters in the same group represent significant differences (P＜0.05); the same below.

5 组有丝状藻塘的生物可利用性磷含量为36.32～103.65 mg/kg，平均为(72.26±10.57) mg/kg。5 组无丝状藻塘的生物可利用性磷含量为29.55～70.32 mg/kg，平均为(50.33±12.62) mg/kg。5 组水源的生物可利用性磷含量为4.55～122.20 mg/kg，平均为(51.13±31.89) mg/kg (图2)。5 组有丝状藻塘平均生物可利用性磷含量较无丝状藻塘高21.93 mg/kg。组1 中，有丝状藻塘、无丝状藻塘及水源之间生物可利用性磷含量无显著差异(P＞0.05)。组2 和组3 中，有丝状藻塘与无丝状藻塘之间生物可利用性磷含量无显著差异(P＞0.05)，但二者均显著高于水源(P＜0.05)。组4 和组5 中有丝状藻塘生物可利用性磷含量均显著高于无丝状藻塘(P＜0.05)，而无丝状藻塘与水源之间无显著差异(P＞0.05)。

图2 5 组池塘各底泥样本的生物可利用性磷含量Fig. 2 Bioavailable phosphorus content of sediment samples from 5 groups of ponds

为了进一步探究氮磷与丝状藻发生的关系，对各池塘及水源的底泥生物可利用性氮磷比做了分析(图3)。由图可知，有丝状藻塘底泥生物可利用性氮磷比值为0.170～0.301，平均为0.230±0.058。无丝状藻塘底泥生物可利用性氮磷比值为0.217～0.410，平均为0.290±0.059。水源底泥生物可利用性氮磷比值为0.139～0.916，变化幅度较大，平均为0.369±0.08。无丝状藻塘底泥的生物可利用性氮磷比值较有丝状藻塘高0.060。另外，有丝状藻塘和无丝状藻塘的生物可利用性氮磷比曲线走势相似，且无丝状藻塘底泥生物可利用性氮磷比值在5 组中均高于有丝状藻塘，组1～5 分别高0.071、0.047、0.025、0.116、0.039，占对应有丝状藻塘的生物可利用性氮磷比值分别为34.98%、27.65%、8.31%、39.46%、21.20%，平均为26.32%。

图3 5 组池塘各底泥样本的生物可利用性氮磷比Fig. 3 Bioavailable N/P ratios of sediment samples from 5 groups of ponds

本次调查中，各组样本检测到的主要真核生物属如图4 (水体)和图5 (底泥)所示。其中在水体和底泥中共检测到5 个水绵属，分别为Spirogyra_sp._1_AS-2014、Spirogyra_sp._4_AS-2014、Spirogyra_sp._5_AS-2014、Spirogyra_sp._9_AS-2014、Spirogyra_sp._M1843，1 个刚毛藻属，为Cladophora_sp._JIAC-WT-filamentous_2。图4 和 图5 反映水绵属和刚毛藻的OTUs 相对量极低。

图4 5 组池塘各水样OTUs 热点图1.未定属；2.微拟球藻属；3.突柄杆菌属；4.隐藻属；5.线虫共生菌属(暂定属)；6.斜片藻属；7.巴夫藻属；8.衣藻属；9.黄杆菌属；10.柄裸藻属；11.水绵属；12.绿梭藻属；13.拟小球藻属；14.金色藻属；15.科利氏藻属；16.四豆藻属；17.镰刀菌属；18.鱼鳞藻属；19.粗盘藻属；20.海链藻属；21.Durinskia (多甲藻目新属)；22.聚球藻属；23.栖湖菌属；24.栅列藻属；25.全沟藻属；26.霍奇金氏菌属(暂定属)；27.麦克属；28.深海铁杆菌属；29.索囊藻属；30.刚毛藻属。Fig. 4 Heatmap of OTUs in water samples from 5 groups of ponds 1. unclassified; 2. Nannochloropsis; 3. Prosthecobacter; 4. Cryptomonas; 5. Candidatus_Xiphinematobacter; 6. Plagioselmis; 7. Pavlova; 8. Chlamydomonas; 9. Flavobacterium; 10. Colacium; 11. Spirogyra; 12. Chlorogonium; 13. Parachlorella; 14. Chrysochromulina; 15. Koliella; 16. Tetrabaena; 17.Falcomonas; 18. Mallomonas; 19. Trachydiscus; 20. Thalassiosira; 21. Durinskia; 22. Synechococcus; 23. Limnohabitans; 24. Scenedesmus; 25. Teleaulax; 26. Candidatus_Hodgkinia; 27. Mychonastes; 28. Mariprofundus; 29. Choricystis; 30. Cladophora.

图5 5 组池塘各底泥样本OTUs 热点图1.未定属；2.土圈菌属；3.微拟球藻；4.突柄杆菌属；5.蓝菌属；6.栅列藻属；7.小环藻属；8.聚球藻属；9.微胞藻属；10.拟小球藻属；11.无隔藻属；12.拟单胞藻属；13.丰佑菌属；14.粗盘藻属；15.线虫共生菌属(暂定属)；16.拟圆孢藻属；17.绿棒菌属；18. Durinskia (多甲藻目新属)；19.盘裸藻属；20.构属；21.鳞孔藻属；22.衣藻属；23.海链藻属；24.裸藻属；25.西索恩氏菌属；26.眉藻属；27.扁裸藻属；28.眼裸藻属；29.刚毛藻属；30.水绵属。Fig. 5 Heatmap of OTUs in sediment samples from 5 groups of ponds 1. unclassified; 2. Pedosphaera; 3. Nannochloropsis; 4. Prosthecobacter; 5. Cyanobium; 6. Scenedesmus; 7. Cyclotella; 8. Synechococcus; 9. Microcystis; 10. Parachlorella; 11. Vaucheria; 12. Monodopsis; 13. Opitutus; 14. Trachydiscus; 15. Candidatus_Xiphinematobacter; 16. Sphaerospermopsis;17. Chlorobaculum; 18. Durinskia; 19. Discoplastis; 20. Broussonetia; 21. Lepocinclis; 22. Chlamydomonas; 23. Thalassiosira; 24. Euglena; 25. Chthoniobacter; 26. Calothrix; 27. Phacus; 28. Euglenaria; 29. Cladophora; 30. Spirogyra.

依据图4 中的数据，统计了水绵属和刚毛藻属OTUs 在各组水体中分布的情况(图6)。在5组15 个水样中，共检测到9 个样本有水绵属OTUs，4 个样本有刚毛藻属OTUs，其中在组1、组3 和组5 的有丝状藻塘中均检测到了刚毛藻属和水绵属OTUs，在组1、组2 和组4 的无丝状藻塘也检测到了少量的水绵属OTUs，在组1 的水源中均检测到了少量刚毛藻属和水绵属OTUs，在组2 和组5 的水源中检测到了少量水绵属OTUs。

图6 5 组池塘各水样刚毛藻和水绵OUTs 数量统计Fig. 6 Number of Cladophora and Spirogyra OTUs in sediment samples from 5 groups of ponds

依据图5 中的数据，统计了水绵属和刚毛藻属OTUs 在各组底泥中分布的情况(图7)。在5组15 个泥样中，共检测到了12 个含有水绵属或刚毛藻属OTUs，其中9 个检测到了水绵属OTUs，9 个检测到了刚毛藻属OTUs。5 组有丝状藻塘底泥中均检测到了刚毛藻属或水绵属OTUs，组2、组4 和组5 无丝状藻塘中检测到刚毛藻属或水绵属OTUs，5 组水源底泥中，除组5 外，其余4 组均检测到了刚毛藻属或水绵属OTUs。

图7 5 组池塘底泥样品刚毛藻和水绵OUTs 数量统计Fig. 7 Number of Cladophora and spirogyra OUTs in sediment samples from 5 groups of ponds

3 讨论

通过检测发现，环境中丝状藻主要组成种水绵和刚毛藻繁殖体分布广泛，外源水水体、底泥中均检测到了繁殖体，而且即使在一些无丝状藻发生的池塘中，也在水体、底泥中检测到了繁殖体的存在，表明在本次调查中，丝状藻繁殖体的有无并不是决定丝状藻是否发生的关键因素。值得注意的是，虽然丝状藻繁殖体分布广泛，但是繁殖体的丰度却明显低于其他大多数真核浮游藻类。

氮磷营养盐是藻类生长的重要因子[21]，而池塘沉积物是养殖生态系统的 “汇” 和 “源”[22]，氮磷大部分沉积在底部沉积物中[23]。一般水产饲料中氮含量明显高于磷含量，理论上沉积物中的氮含量要高于磷。但是，刘金金等[24]对养殖前中后期的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)池塘沉积物检测发现，沉积物中总氮并未见明显积累。在本次调查中，也发现10 口池塘的生物可利用性氮磷比也均在0.5 以下。造成上述情况的原因有两个方面：①氮的沉积率较磷低，氮的沉积率约为水体滞留率的3 倍，而磷则约为17 倍[25]；②有机氮在养殖系统中容易发生反硝化作用[25]和氨化作用[26]。因此，沉积物中的氮磷比并没有预期的高。然而，氮磷比是藻类生长的关键因子，影响着藻类的生长和演替[27-28]。藻类细胞组成的原子比率C∶N∶P=106∶16∶1，当氮磷比小于 10∶1 则会出现氮抑制[29]。丰茂武等[21]研究发现，在不同氮磷比条件下，浮游藻类最佳生长条件为氮磷比40∶1，藻类生长取决于氮的质量浓度。朱旭宇等[30]研究也发现，氮磷比对浮游植物群落的丰度、物种数及叶绿素a含量都有重要影响，而且氮磷比越高浮游植物丰度越高，氮磷比越低则浮游植物丰度也越低。然而，在本次调查中发现，作为养殖初期氮磷营养 “源” 的底泥，其生物可利用性氮磷比均较低，尤其是有丝状藻池塘，平均生物可利用性氮磷比低至0.23，较无丝状藻塘低26.32%。刘金金等[24]研究发现，凡纳滨对虾池塘的可利用氮质量分数为 57.53～85.31 mg/kg，而本次调查中，有丝状藻塘的生物可利用性氮含量仅为15.72 mg/kg。因此，底泥中低生物可利用性氮磷比叠加低于实际生物可利用性氮含量，导致了在养殖池塘进水初期浮游藻类的生长繁殖严重受阻，然而，以刚毛藻、水绵为主要组成种的丝状藻则具有很强的储存硝酸盐氮的能力，使得它们在开发和利用瞬态营养供应方面有很强的竞争力[31-32]，并且它们具有很强的生理耐受性和可塑性，能在寡营养环境中改变自身的形态、繁殖和生长特点[33-35]，所以，在养殖池塘进水初期，虽然浮游藻类较丝状藻繁殖体有更高的丰度，但其在与丝状藻的生态位竞争中仍处于劣势，并且一旦丝状藻在初期生态位竞争中占据优势，凭借其强生长繁殖能力，水体氮磷失衡就难以再逆转，浮游植物也一直处于被抑制的低丰度状态。本次调查的5 组池塘中，5 组有丝状藻池塘的叶绿素a均低于无丝状藻池塘，并且有4 组有丝状藻池塘的叶绿素a显著低于无丝状藻池塘(P＜0.05)，此结果印证了上述结论。

研究表明，单独依靠生石灰或漂白粉清塘并不能完全杜绝丝状藻的发生，但可以作为一个辅助防控措施。而通过调控养殖系统的生物可利用氮含量及氮磷比来调控种间生态位竞争则是一个值得深入研究的、有前景的丝状藻防控方向。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）