鱼类白介素10 的研究进展

黎秋男， 李书含， 周永恒， 耿 毅， 黄小丽， 陈德芳， 欧阳萍*

(1. 四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2. 四川农业大学动物科技学院，四川 成都 611130)

白介素10 (interleukin 10, IL-10)是一种多功能的细胞因子，具有免疫抑制和免疫增强的作用，但是其主要功能为免疫抑制，可以抑制单核/巨噬细胞的活性，进而抑制细胞因子合成、一氧化氮产生和其他协同刺激因子的表达，能够抑制甚至结束炎症反应，进而防止过度炎症反应对机体的损伤[1]。IL-10 家族的成员有 IL-19、IL-20、IL-22、IL-24 及IL-26。IL-10 家族的所有成员都具有相似的基因和蛋白质结构，同时能够利用类似的受体复合物。此外，部分病毒(如EB 病毒、绵羊痘病毒)也编码宿主IL-10 的类似物，称为病毒IL-10(vIL-10)，目前已知有21 种病毒能够编码vIL-10，部分vIL-10 被证实具有与宿主IL-10 相似的蛋白结构和生物学功能[2]。

IL-10 是机体内最重要的抗炎细胞因子之一，其来源主要是单核细胞、巨噬细胞和不同类型的T 淋巴细胞[3]。此外，树突状细胞、B 细胞、NK细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也能合成分泌IL-10，然而大多数组织细胞类型不能分泌产生IL-10[4-5]。单核/巨噬细胞是IL-10 主要作用细胞，其影响单核/巨噬细胞抗原呈递、免疫介质的释放和吞噬作用[4]。此外，有研究报道IL-10 也具有一定免疫刺激作用，能够调节B 细胞、NK 细胞、细胞毒性和辅助性T 细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、角质细胞和内皮细胞的生长或分化，以及促进抗体的产生[1]。因此，有报道认为IL-10 的免疫调节作用大于其抗炎作用。

1989 年，Fiorentino 等[1]发现小鼠Th2 细胞分泌一种独特的细胞因子，命名为细胞因子合成抑制因子(CSIF)，随后命名为IL-10。1991 年，Vieira等[6]在人类基因组中发现了IL-10 基因，随后IL-10 基因在多种哺乳动物中被发现和克隆。2004 年，Rothwell 等[7]成功从鸡中克隆了IL-10 基因。在鱼类中，2003 年Zou 等[8]首次从红鳍东方鲀(Takifugu rubripe)基因组分析中获得了鱼类IL-10 基因。同年，Savan 等[9]在鲤(Cyprinus carpio)中克隆获得了IL-10 基因，随后在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[10]、斑马鱼(Danio rerio)[11]、舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)[12]、大西洋鳕(Gadus morhua)[13]、金鱼(Carassius aurutus)[14]、草鱼(Ctenopharyngodon idella)等[15]鱼类中也克隆出IL-10 基因。此外，vIL-10 也在21 种病毒中有报道，其中包括鲤疱疹病毒3 型(CyHV-3)和鳗鲡疱疹病毒(AngHV)两种鱼类病毒[2]。本文根据已有的报道，从鱼类IL-10 的基因结构、转录表达、鱼类IL-10 的来源与进化、生物学活性、鱼类IL-10 的受体和信号通路共5 个方面进行了综述，为鱼类IL-10 的功能研究和应用提供依据。

1 鱼类IL-10 的基因结构

1.1 鱼类IL-10 基因的发现和克隆表达

2003 年，Zou 等[8]首次在低等脊椎动物红鳍东方鲀基因组序列分析中发现鱼类IL-10 基因，该基因位于2 790 bp 的片段中，其中包括549 bp的氨基酸编码序列，生物信息学分析推导其氨基酸序列与哺乳动物IL-10 序列具有44%～50%同源性，与vIL-10 具有39%～42%的同源性，与IL-10家族其他成员具有37%～42%的同源性，并且证实该基因在正常组织中呈低水平表达。同年，Savan等[9]在鲤的头肾中克隆了IL-10 基因，发现IL-10基因序列长度为2 083 bp，包含5 个外显子和4 个内含子，除了内含子更紧密外，其基因组结构与哺乳动物IL-10 相似，鲤IL-10 cDNA 全长1 096 bp，包含 55 bp 的 5′非翻译区(UTR)、543 bp 的开放阅读框和498 bp 的 3′非翻译区，其中开放阅读框编码180 个氨基酸，包含22 个氨基酸的信号肽。此外，该研究还证实鲤IL-10 基因在正常鲤的头肾、脾脏、肠道和鳃中均有表达，其中头肾和肠道中表达量最高[9]。2006 年，肖凡书等[16]运用RACEPCR 方法成功克隆获得了鲢 IL-10 的 cDNA，其全长 1 248 bp，包含 156 bp 的 5′非翻译区、540 bp的开放阅读框和552 bp 的3′非翻译区，运用原核表达系统成功获得了鲢IL-10 的重组蛋白，并且发现鲢IL-10 mRNA 主要在脾脏、鳃、头肾和肌肉中表达。

鲤和虹鳟存在2 种IL-10，分别命名为IL-10a和IL-10b，鲤IL-10a和IL-10b具有相似的基因和蛋白结构，并且在鲤吞噬细胞上都表现出相似的生物学活性，IL-10a在正常组织中表达量较高，IL-10b在病原感染时发挥着主要调节作用[17]。Harun 等[18]对虹鳟的2 个IL-10 基因进行了比较，IL-10a的表达通常高于IL-10b，还证实IFN-γ 通过不同的细胞或者细胞系抑制IL-10a或IL-10b的表达，表明虹鳟体内可能存在两个调节IL-10 基因表达的途径。目前，在GenBank 数据库中有150 多种鱼类IL-10 的基因序列，其中虹鳟、斑马鱼、舌齿鲈、大西洋鳕、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)、草鱼、大黄鱼(Larimichthys crocea)、黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)、金鲳(Trachinotus ovatus)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等18种鱼类IL-10 基因被克隆(表1)。

表1 鱼类IL-10 的克隆表达Tab. 1 Expression of IL-10 in fish

1.2 鱼类IL-10 的基因结构

人、鼠及鱼类IL-10 的基因结构相似，都是由5 个外显子和4 个内含子组成，不同物种间外显子编码的氨基酸数量相近，内含子长度存在差异，鱼类IL-10 的内含子比人和鼠IL-10 的内含子数量如图1 所示。人IL-10 的基因长度为4 892 bp，编码的蛋白含178 个氨基酸，其中N 端18 个氨基酸预测为信号肽[9]。鱼类IL-10 与人IL-10 一样，包含了6 个保守区域，但是相互作用位点存在显著差异。鱼类IL-10 基因第 1 个外显子编码信号肽和 A 螺旋结构，第 2 个外显子编码 AB 鲁普结构和 B 螺旋结构，第 3 个外显子编码 C 和 D 螺旋结构，第 4 个外显子编码 DE 鲁普结构和 E 螺旋结构，第 5 个外显子编码 F 螺旋和羧基端的尾巴以及 1 个不翻译的包括 AUUUA 的片段，当这个片段与 AUF1 结合时，会降低IL-10 mRNA 的稳定性[33]。

图1 鱼类IL-10 内含子/外显子结构示意图Fig. 1 Genomic exon/intron organization of fish IL-10

人、鼠、猫、鸡与虹鳟等鱼类IL-10 编码的氨基酸数量为175～189 (表1)。鱼类IL-10 氨基酸序列与高等脊椎动物的同源性较低，如鲤 IL-10的氨基酸序列与鲫的同源性高达 90%，与鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、草鱼、斑马鱼，同源性分别为 88.0%、85.5%、79.1%，与其他硬骨鱼类的同源性为 39.0%～56.0%，与哺乳动物的同源性为 25.0%～30.0%[34]。斑马鱼的 IL-10 氨基酸序列与其他哺乳动物氨基酸序列相似度为30%左右，与草鱼的相似度为达到80.9%[11]。

目前已知所有物种成熟IL-10 蛋白都含有4个半胱氨酸残基，鸡的IL-10 缺乏潜在的N-链糖基化位点，而在小鼠中有2 个，在人IL-10 中有1个[7]。另外，运用3D 模型分析显示，鱼类IL-10中存在2 个高度保守的氨基酸残基(Cys5 和Cys10)，在高级脊椎动物(包括人) IL-10 中没有[33]。

IL-10 蛋白的分子质量为17～19 ku，包含2 个二硫键桥，并以非共价同源二聚体的形式表达[35]。同源二聚体有2 个V 形结构域，每个结构域由6个α 螺旋组成。在IL-10 单体中，存在2 个二硫键桥，对维持细胞因子的结构和生物活性至关重要。对虹鳟2 个IL-10 基因、斑马鱼IL-10 基因和大西洋鳕IL-10 基因编码蛋白的三级结构进行预测，结果如图版Ⅰ所示，鱼类IL-10 三级结构是由α-螺旋和无规则卷曲组成的双重对称的倒V 型二聚体，并且结构域间角度都比较接近，与先前鱼类IL-10 三级结构预测结果一致[2]。

图版 Ⅰ 几种鱼类的三级结构预测1.虹鳟IL-10a，2.虹鳟IL-10b，3.斑马鱼IL-1，4.大西洋鳕IL-10。Plate Ⅰ Three-level structure prediction of several fishes 1. IL-10a of O. mykiss; 2. IL-10b of O. mykiss; 3. IL-10 of D. rerio; 4 IL-10 of G. morhua.

2 鱼类IL-10 的转录表达

IL-10 在鱼类正常组织中的表达量很低，受到脂多糖刺激、细菌感染、免疫激活剂刺激时 IL-10的表达会显著上调。Zou 等[8]研究了红鳍东方鲀IL-10 的组织分布，发现 IL-10 在河鲀肝脏、肾脏、肠道和脊髓中均有低水平表达，而在脾脏、鳃、脑和性腺中均未检测到表达。鲢IL-10 主要在脾脏、鳃、头肾和肌肉中表达，脑、心脏、肠道中有少量表达，肝脏和脊髓中几乎没有表达。Savan等[9]在证实鲤 IL-10 在头肾、脾脏、肠道和鳃中都有表达，在头肾和脾脏中表达量相对较高，LPS刺激后的肝脏中也有表达，LPS 刺激 1 和 3 h 后头肾中 IL-10 表达量显著上调，表明鱼类 IL-10 可能参与机体抗菌反应。Jiang 等[36]通过poly I：C刺激大西洋鳕后发现，IL-10 表达水平在早期显著升高，表明IL-10 在mRNA 水平上可能参与宿主早期的免疫反应。IL-10 在不同鱼类中的表达模式也有所不同，Xu 等[37]发现维罗尼气单胞菌(Aeromonas veronii)感染黄鳝(Monopterus albus)后，IL-10 在细菌感染后期表达显著升高，表明IL-10 可以调节宿主后期的免疫反应。

3 鱼类IL-10 的进化和来源

高等脊椎动物IL-10 的特征、功能和调节机制等已经被解析得较清楚，但是关于硬骨鱼IL-10 的调节机制及其在疾病中的作用研究还十分有限。T 细胞亚群是IL-10 的主要细胞来源[38]，但是对于鱼类IL-10 的细胞来源还缺乏研究。鱼类具有TCR、CD3、CD4 等T 细胞标志基因[39]，与哺乳类不同，鱼类CD4 基因有2 个拷贝，即CD4-1和CD4-2。与CD4-2 相比，CD4-1 与哺乳动物CD4 的亲缘关系更近，CD4-1 胞外区有4 个Ig 结构域，而CD4-2 具有2 个或3 个Ig 结构域[40-41]。Toda等[42]证明硬骨鱼类存在CD4+和CD8α+T 细胞亚群，其形态特征和组织分布与哺乳动物CD4+和CD8+T 淋巴细胞相似，并发现CD4+/CD8+双阳性T 细胞仅存在于胸腺中。鱼类具有和哺乳动物相似的T 淋巴细胞亚群，推测鱼类IL-10 也可能来自于T 淋巴细胞，Li 等[43]研究发现，罗非鱼活化的T 细胞可以产生IL-10。Grayfer 等[44]成功表达了金鱼重组IL-10 和重组IL-10R1 蛋白并通过体外结合研究表明rgIL-10 和rgIL-10R1 可以特异性结合。Huo 等[25]研究发现鳜(Siniperca chuatsi)具有保守的受体结合物，并能与其特异性结合。因此，鱼类IL-10 在进化过程中一直保持高度保守。

根据表1 中IL-10 的氨基酸序列，利用Mega 7 软件采用邻接法(Neighbour-Joining)构建系统发育树(图2)。根据系统进化树进行分析，IL-10 进化树分为两个大分支，所有鱼类IL-10 聚为一个大支，虹鳟2 个IL-10 蛋白聚为一支，亲缘度100%，而其他哺乳动物(如人、鼠、鸡等) IL-10与水生哺乳动物宽吻海豚IL-10 聚为一支。

图2 鱼类IL-10 的进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of fish IL-10

4 鱼类IL-10 生物学功能研究

IL-10 是一种重要的抗炎细胞因子，其主要免疫调节功能主要是抑制吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞)中促炎细胞因子的合成及抑制抗原递呈与细胞表面MHC 类基因的表达、T 细胞和非免疫细胞的增殖与活化功能[45]。除了免疫抑制特性外，IL-10 也具有一定的免疫刺激作用，如促进B 细胞与T 细胞的生长分化[46]。鱼类IL-10 的功能与结构与人类IL-10 的类似，因此同时具有免疫抑制和免疫促进的双重作用。

人IL-10 在许多炎症性疾病的发生发展中起作用。如IL-10 降低可以加速形成B 细胞肿瘤，并且IL-10 缺失还会增加B 细胞肿瘤突变的概率，因此IL-10 与白血病转化有着密切的关系[47]。此外，IL-10 还与神经性疼痛、帕金森病、阿尔茨海默病、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮、1 型糖尿病、炎症性肠病和过敏等有联系。

4.1 鱼类IL-10 的免疫抑制作用

已有研究报道鱼类IL-10 可以抑制金鱼、鲤、鳜、舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、草鱼及斑马鱼等鱼类的单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及脾细胞等体细胞的TNF-α1、TNF-α2、IL-1β1 和iNOS 等促炎细胞因子的表达。Grayfer 等[14]发现金鱼IL-10 可以抑制由沙门氏菌诱导的单核细胞中TNF-α1、TNF-α2 和IL-1β 的表达。Carla 等[48]研究发现，鲤IL-10 能够抑制巨噬细胞及中性粒细胞IL-1β、TNF-α、iNOS 和IL-6 等促炎因子及MHC基因的表达。鳜重组IL-10 降低了LPS 刺激后脾细胞IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α 等细胞因子表达的水平[25]。李佳琪[49]使用纯化重组尼罗罗非鱼IL-10 蛋白对T 淋巴细胞进行刺激，可以抑制胞内IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2 的转录水平。在体外激活的T 细胞内加入纯化IL-10 重组蛋白，发现IL-10 抑制了CD44、CD122、IL-2、IFN-γ 等T 细胞内活化标志物的转录水平。金鱼重组 IL-10能够抑制单核细胞中 TNF-α1、TNF-α2、IL-1β1、CXCL-8 和 SOCS-3 以 及 脾 脏 细 胞 中IFN-γ 的 表达[14]。上述结果表明，鱼类 IL-10 具有免疫抑制功能，能够参与鱼类免疫调节。

IL-10 主要作用于单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞[48]。金鱼重组Il-10 蛋白能显著抑制由沙门氏菌和干扰素诱导的单核细胞爆发[14]。除此之外，鲤IL-10 在抑制氮氧自由基产生、抑制mRNA的转录及阻断蛋白降解等方面也有相关的研究。Carla 等[48]发现鲤重组IL-10 可以抑制PMA 和LPS 诱导的巨噬细胞和中性粒细胞自由基，阻断蛋白降解，抑制mRNA 转录[48]。中华鳜IL-10 可以抑制PMA 诱导的氧自由基生成[25]。IL-10 对于中性粒细胞主要通过诱导IRF 破坏以及间接通过NF-κB 通道产生抑制作用[50]。此外，IL-10 对T 淋巴细胞的增殖也有一定作用，如削弱其细胞毒性[43]。

IL-10 在病原感染过程中同样发挥着重要的调节作用。Xu 等[37]研究发现，黄鳝IL-10 在健康组织中表达较低，但在感染维罗尼气单胞菌后表达显著上调。Huo 等[25]发现鳜感染传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)后，脾脏IL-10 的表达显著上调。Wang 等[51]发 现，斑 石 鲷(Oplegnathus punctatus)在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和斑点刀颚虹膜病毒(SKIV)感染时，IL-10 在6 个组织均有表达上调，其中肝脏IL-10 在整个感染期内表达均有升高，表明肝脏中的IL-10 在病原感染时发挥重要作用。IL-10 发生突变的斑马鱼通过限制ifng1 反应来提高自身在感染海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)后的存活率[52]，IL-10 在机体对抗病原体感染过程中起到积极的调节作用。但是，Li 等[53]在细菌感染半滑舌鳎中发现，当存在rCsIL-10 时，促炎因子的表达受到显著抑制，同时细菌感染加剧。当敲低CsIL-10 后发现细菌的感染受到了抑制，此外，IL-10 通过与PBL 相互作用从而影响PBL 对细菌的吞噬作用。当阻断CsIL-10 受体时，CsIL-10 对PBL 的抑制作用下降，促炎因子表达上升，细菌感染受到抑制，表明IL-10 及其受体在细菌感染过程中起负调控作用[54]。

鱼类IL-10 还可以抑制MHC 类分子表达，目前发现鲤IL-10 与CyHV-3 vIL-10 能够抑制MHC I 与MHC II 的表达。Piazzon 等[55]发现普通鲤在LPS 刺激下MHC I 与MHC II 表达增加，添加鲤IL-10 能抑制MHC I 与MHC II 的表达。

此外，有研究表明，IL-10 突变斑马鱼肠道杯状细胞数量的升高可能与Notch 通道受损有关，后续通过激活Notch 通道传导来抑制杯状细胞的增加，证实了IL-10 可以通过Notch 通路对杯状细胞产生抑制作用[56]。

4.2 鱼类IL-10 的免疫刺激作用

IL-10 能够刺激淋巴细胞的增殖分化与抗体产生。在体外IL-10 可以刺激B 细胞增殖，体内IL-10 可以刺激硬骨鱼B 细胞和T 细胞的增殖分化[55,57]。Abos 等[58]发现虹鳟体内的IL-10 可以刺激B 细胞增殖分化且促进IgM 分泌。另外IL-10可以刺激免疫细胞内蛋白质的表达。Yang 等[59]发现扁口鱼(Paralichthys olivaceus)重组IL-10 蛋白可以诱导B 细胞中NLRC 和Scarf1 的表达。Neranjan等[30]用qPCR 量化大腹海马巨噬细胞，发现IL-10 可以促进STAT3 和SOCS3 mRNA 的表达。

4.3 鱼类病毒IL-10 的活性研究

已知CyHV-3 与AngHV-1 能够编码病毒IL-10，目前仅有CyHV-3 IL-10 相关生物学活性的报道。CyHV-3IL-10 被证实是病毒体外复制和体内致病性的非必需基因。通过原核表达方式获得CyHV-3 IL-10 重组蛋白，证实其在抑制炎症因子表达方面与鲤IL-10 具有相似功能，Piazzon 等[57]发现CyHV-3 IL-10 可以抑制中性粒细胞和巨噬细胞的呼吸爆发及氮氧自由基的产生。Sunarto 等[60]发现CyHV-3 IL-10 也可以通过IL-10 受体亚基IL-10R1作用，增加白细胞数量。也有一些研究表明，CyHV-3 IL-10 能促进B 细胞增殖分化，并促进其表面MHC I 的表达[57]。CyHV-3IL-10 基因在注射到斑马鱼胚胎中时会增加溶菌酶细胞的数量，具有斑马鱼IL-10 相似的作用[61]。

5 鱼类IL-10 的受体和信号通路研究

IL-10R1 和IL-10R2 为IL-10 的受体，IL-10是由二者组成的跨膜受体复合物，IL-10R1 与IL-10R2 都属于II 类细胞因子受体家族。IL-10R1 主要在免疫细胞上表达，而IL-10R2 可在大多数细胞上表达[4]。IL-10 首先与IL-10R1 结合，形成IL-10/IL-10R1 复合物，继而IL-10/IL-10R1 复合物与IL-10R2 结合[62]。该配体-受体组合激活Janus 激酶家族成员Janus 激酶1 (Jak1)和酪氨酸蛋白激酶2(Tyk2)，这些活化的激酶可磷酸化IL-10R1 细胞质部分，进而募集并激活STAT3 的信号转导器和激活剂，从而引起各种下游基因的转录[63]。因此，STAT3 被认为是IL-10 活动的重要中介[64]。在IL-10诱导的基因中，SOCS3 参与IL-10 介导的免疫抑制作用[65]，且对Jak-STAT 途径也具有抑制作用[66]。

有研究表明，鱼类IL-10 信号通路与高等脊椎动物相似，都可通过STAT3 磷酸化的保守信号，导致宿主细胞中SOCS3 表达上调，从而发挥生物学活性。目前在草鱼中检测到IL-10R1 与IL-10R2 受体，部分硬骨鱼中鉴定出了STAT3 的存在，研究发现部分鱼中含有不止1 个 STAT3 基因，如鲤经IL-10 作用后，其STAT3 水平增高[57]，草鱼中含有 STAT3α1 和 STAT3α2[67-68]。经研究验证，鱼类2 个STAT3 转录本都具有入核与转录调控的活性，暗示在硬骨鱼中存在功能冗余的STAT3 亚型[68]。细胞因子SOCS3 是 IL-10/JAK/STAT 信号通路所转录表达的关键基因，在鮸 (Miichthys miiuy)等硬骨鱼中存在着SOCS3a和SOCS3b基因[69]。在草鱼中检测到SOCS3 基因对 IL-10 信号的响应表达，表示鱼类 IL-10 信号也通过上调SOCS3 基因而放大抑制影响，表明硬骨鱼中很可能存在保守的免疫抑制性调控机制[70]。在斑马鱼和哺乳动物中存在IL-10-Notch 轴，可以调节杯状细胞稳态和黏蛋白的产生[56]。

6 展望

在过去30 年中，人IL-10 的结构与功能已有广泛的研究，并且在一些免疫性疾病治疗中有应用。多种鱼类IL-10 已经成功克隆并鉴定，发现鱼类IL-10 与人IL-10、哺乳动物IL-10 和禽类IL-10 具有相似的基因结构、氨基酸数量、二级结构和三级结构，同时也证明了鱼类IL-10 具有免疫抑制和免疫增强作用。此外，鱼类IL-10 的受体以及信号通路方面的研究也有了一定的进展。但是对于鱼类IL-10 的起源和进化方面的研究尚存在不足，哺乳动物IL-10 主要来源于单核细胞、巨噬细胞和T 淋巴细胞及其亚群，鱼类具有和哺乳动物相似的T 淋巴细胞亚群结构，推测鱼类IL-10 也可能来自于T 淋巴细胞及其亚群，但是目前暂无实验证明。因此，关于鱼类IL-10 的研究可以着重于其具体来源、揭示鱼类疾病病理以及应用于治疗。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）