Hh信号通路分子TPX2对口腔鳞癌增殖的作用探讨

张洪瑞，苏本香，庞艳，孙月茹

呼伦贝尔职业技术学院口腔教研室，内蒙古呼伦贝尔 021000

口腔癌是发生于口腔黏膜的恶性肿瘤，主要包括唇颊黏膜、舌前2/3、硬腭、牙龈以及口底等部位，其中病理类型以鳞癌最常见。印度、东南亚为口腔癌的高发区，男性发病率约为女性的2倍[1]。目前口腔鳞癌的治疗方案多为以手术为主的放化疗等综合治疗，但是很难持续改善患者的预后，并且大多数进展期患者在治疗后仍然复发[2]。因此需要识别促进口腔鳞癌增殖的分子，从而研制有效的靶向治疗药物治疗口腔鳞癌，降低疾病的复发率和病死率[3]。口腔鳞癌发生的分子机制仍然不清楚，有研究表明叉头盒M1（Forkhead Box Protein M1,FOXM1）是癌胚转录因子及细胞周期的调节因子，靶向Xklp2靶蛋白（Targeting Protein for Xenopus Kinesin-like Protein 2, TPX2）是有丝分裂的关键癌基因，但是如何促进口腔鳞癌发生与发展仍不明确[4-5]。本研究选取2022年1月—2023年7月呼伦贝尔职业技术学院口腔教研室培养的6株CAL-27人口腔鳞癌细胞株为研究对象，旨在探讨与分析Hedgehog（Hh）信号通路分子TPX2对口腔鳞癌增殖的作用，以明确TPX2的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CAL-27人口腔鳞癌细胞株（美国ATCC）；DMEM培养基（美国Gibco）；GANT61及cyclopamine（美国Sigma-Aldrich）；Puromycin（北京Solarbio）；转染试剂lipofectamine 2000 transfection reagent和总RNA提取试剂（美国Thermo Fisher Scientific）；DMEM细胞培养基（美国Gibco）；FOXM1抗体、TPX2抗体（英国Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 TPX2 shRNA获取及RT-qPCR Genbank数据库确定人TPX2的基因序列，针对TPX2的基因序列设计1条shRNA，shTPX2序列：5'-AGCCAAGTTGTGCAATGTTC-3'，由苏州吉玛基因公司设计合成。采用TRIzol法提取试剂盒对细胞总RNA进行提取，RNA的纯度和浓度的测定应用紫外分光光度计，取2 μl RNA，在反转录酶作用下合成cDNA，再取2 μl反转录产物PCR扩增，以磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase, GAPDH）为内参照，PCR反应条件：①95℃ 5 min，②95℃ 30 s，③60℃ 30 s，④72℃ 30 s，⑤72℃ 5 min；其中②、③、④为40个循环。

1.2.2 细胞分组与转染 把CAL-27细胞随机分为两组：对照组与Lv-shTPX2组。取对数生长期细胞，待细胞融合度达到70.0%～80.0%后，对照组与Lv-shTPX2组分别用lipofectamine 2000细胞转染试剂转染Lv-pc3.0 vector与Lv-pc3.0-shTPX2，转染终浓度为10 nmol/L，转染后12 h更换培养液。

1.2.3 细胞增殖 将转染后培养48 h的细胞消化离心，显微镜下计数，以细胞5 000个/孔的密度接种于96孔板，24 h后培养基中加入50 μmol/L Edu再孵育1～4 h，每次实验每孔重复3次，只显示1个有代表性的区域。

1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期 将细胞消化、传代、培养24 h后换液，继续培养至72 h，0.25%胰酶消化成单细胞悬液，磷酸缓冲生理盐水（Phosphate Buffer Saline, PBS）洗涤2次，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，缓慢加入-20℃预冷的75%乙醇，4℃保存，取细胞悬液，PBS洗涤，2 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染液1 mL，染30 min，每样本收集10 000个荧光信号，得出各期细胞数占细胞总数的百分率，每组重复3次。

1.2.5 蛋白印迹法检测目的蛋白的表达 培养细胞经预冷的PBS漂洗2次，吸净PBS，加入预冷的裂解液置于冰上。将研磨液置于离心管中震荡，间断吹打，共约30 min，反复吹打，超声破碎，置于4℃离心机中，以13 000 r/min的转速离心15 min，取上清液置于新的EP管中，加入蛋白上样缓冲液，反复吹打，利用BCA法定量蛋白，制备10%SDS-PAGE凝胶，上样，转膜，5%牛奶在室温孵育2 h，TBST洗3次，10 min/次，单克隆抗体GLI2、FOXM1以及TPX2（1 ∶ 3 000），GAPDH（1 ∶ 5 000），在4℃摇床过夜，TBST洗3次，10 min/次。二抗孵育：膜与相应的二抗在室温下孵育2 h。显色剂混合，滴于膜上。

1.3 观察指标

比较两组细胞的TPX2表达水平、细胞增殖指数、细胞周期（G1期、S2期、G+M期）相对比例、目的蛋白（GLI2、FOXM1）相对表达水平。

1.4 统计方法

使用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料（TPX2表达水平、细胞增殖指数、细胞周期相对比例、目的蛋白相对表达水平）用（±s）表示，行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞TPX2表达水平对比

转染后24、48 h，Lv-shTPX2组的TPX2 mRNA与蛋白相对表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组细胞TPX2表达水平对比（±s）

表1 两组细胞TPX2表达水平对比（±s）

组别Lv-shTPX2组（n=3）对照组（n=3）t值P值转染后24 h mRNA 5.44±0.17 24.59±0.33 89.352＜0.05蛋白2.01±0.23 10.47±0.16 52.299＜0.05转染后48 h mRNA 5.18±0.47 24.58±2.76 12.002＜0.05蛋白1.33±0.16 7.48±0.33 29.045＜0.05

2.2 两组细胞增殖指数对比

转染后24、48 h，Lv-shTPX2组的细胞增殖指数低于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 两组细胞增殖指数对比[（±s），%]

表2 两组细胞增殖指数对比[（±s），%]

组别Lv-shTPX2组（n=3）对照组（n=3）t值P值转染后24 h 33.59±2.03 67.24±8.42 6.729＜0.05转染后48 h 45.32±3.48 83.76±9.22 6.756＜0.05

2.3 两组细胞周期相对比例对比

转染48 h后，Lv-shTPX2组的G2+M期细胞相对比例高于对照组，S期细胞相对比例低于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表3。

表3 两组细胞周期相对比例对比[（±s），%]

表3 两组细胞周期相对比例对比[（±s），%]

组别Lv-shTPX2组（n=3）对照组（n=3）t值P值G1期50.43±3.59 45.56±4.44 1.477 0.214 S期29.84±4.09 42.24±3.75 3.871＜0.05 G2+M期19.87±2.14 10.33±1.57 6.226＜0.05

2.4 两组细胞目的蛋白相对表达水平对比

转染48 h后，Lv-shTPX2组的GLI2、FOXM1蛋白相对含量低于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表4。

表4 两组细胞目的蛋白相对表达水平对比[（±s），%]

表4 两组细胞目的蛋白相对表达水平对比[（±s），%]

组别Lv-shTPX2组（n=3）对照组（n=3）t值P值GLI2 1.48±0.22 5.58±1.00 6.936＜0.05 FOXM1 1.57±0.33 6.01±0.57 11.676＜0.05

3 讨论

口腔鳞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，80.0%发生于口腔黏膜的癌症为鳞癌[5]。口腔鳞癌患者的预后比较差，5年生存率不到50.0%[6-7]，肿瘤转移和放化疗耐受是口腔鳞癌致死的主要原因，为此需要为治疗口腔鳞癌寻找一条新的途径。有研究证实口腔鳞癌中Hh信号通路处于异常激活状态，但Hh信号通路如何调节肿瘤生长需要进一步研究[8]。同时目前有多种靶向抑制Hh通路的药物，主要为环靶明，但研究报道肿瘤细胞对环靶明产生耐药，因此需要进一步研究Hh信号通路下游分子，寻找直接导致口腔鳞癌细胞增殖和生长的原因，从而针对性研制出靶向治疗药物[9]。

TPX2是一种在多种肿瘤中呈高表达的癌基因，可促进有丝分裂纺锤体的形成，在细胞分裂及肿瘤的形成中也发挥有重要的作用，然而TPX2的表达调节机制仍不清楚[10]。本研究结果显示，转染后24、48 h，Lv-shTPX2组的TPX2 mRNA[（5.44±0.17）、（5.18±0.47）]与蛋白相对表达水平[（2.01±0.23）、（1.33±0.16）]低于对照组的TPX2 mRNA[（24.59±0.33）、（24.58±2.76）]与蛋白相对表达水平[（10.47±0.16）、（7.48±0.33）]（P均＜0.05）；在尹颂豪等[11]的相关研究中显示，在转染TPX2-siRNA后，TPX2 mRNA在48 h后表达下调（F=224.8，P＜0.001）；TPX2蛋白质在72 h后表达下调（F=10.69，P=0.022）。Lv-shTPX2组的细胞增殖指数低于对照组（P＜0.05），表明抑制Hh信号通路分子TPX2的表达可抑制口腔鳞癌细胞增殖。当前也有研究显示，TPX2持续高表达后，Edu染色、细胞增殖曲线及克隆形成实验证实口腔鳞癌细胞生长加速，sonic hedgehog （Shh）信号通路通过TPX2促进口腔鳞癌细胞增殖[12]。

在口腔鳞癌所有异常调节的信号通路中，Hh信号通路对肿瘤的增殖有重要的作用，TPX2是Hh信号通路的下游的靶基因[8]。GLI是重要的转录因子，调控Hh信号由胞质到胞核中，敲除GLI，TPX2的表达下降，GLI异常激活，TPX2的表达升高。激活Hh配体，Shh、TPX2表达亦升高[13]。FOXM1在高度分化和未分化的组织细胞中没有表达，而在增殖的上皮细胞和间充质细胞表现出高度活性，加速细胞周期进程，在正常组织受到损伤后，FOXM1的表达直接参与损伤后修复，为此异常激活的FOXM1作为癌基因而促进癌症的发生发展[14]。本研究结果显示，转染48 h后，Lv-shTPX2组的G2+M期细胞相对比例高于对照组，S期细胞相对比例低于对照组，Lv-shTPX2组的GLI2、FOXM1蛋白相对含量更低，（P均＜0.05），表明抑制Hh信号通路分子TPX2的表达可抑制GLI2、FOXM1蛋白表达，还可调节细胞周期状况。

综上所述，抑制Hh信号通路分子TPX2的表达可抑制口腔鳞癌细胞增殖，也可抑制GLI2、FOXM1蛋白表达，还可调节细胞周期状况，可为治疗口腔鳞状细胞癌提供新的途径。