转录组学在干眼研究中的应用△

罗 丹 李 凯 高卫萍

干眼是由于泪膜失稳、泪液高渗、眼表炎症损伤及神经感觉异常等引起的眼表多因素疾病[1]。其主要症状包括眼干涩、异物感、视物疲劳及视力波动等,严重影响患者的工作及生活。目前对于干眼的发病机制尚未完全阐明,但已有越来越多的证据表明,泪液高渗及眼表炎症是导致干眼发生的主要原因[2]。人工泪液局部滴眼作为当前治疗干眼的一线疗法,往往只能暂时缓解症状,无法有效根治干眼,且容易造成病情反复;糖皮质激素及免疫抑制剂等药物的长期使用,会造成眼压升高、重复感染等不良反应,对眼表有一定的损害作用,不利于病情恢复[3]。研究表明,基因疗法对于干眼的治疗具有潜在的应用价值[4]。随着转录组学技术在眼科领域的广泛应用,人们对干眼关键基因的表达调控机制有了更深入的了解。本文就转录组学在干眼研究中的应用展开综述,探讨干眼的发病机制,以期为临床上干眼的治疗提供新思路,为干眼新药的研发提供潜在靶点。

1 转录组学概述

1.1 转录组学定义

转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科[5]。转录组学从RNA水平研究基因的表达,它是研究细胞表型和功能的一个重要手段。Velculescu等[6]在研究酵母细胞基因表达时首次提出了转录组这一概念。狭义转录组仅指细胞在特定环境下负责编码蛋白质的信使RNA (mRNA);广义转录组是指在特定细胞、组织或整个生物体中表达的所有类别RNA总和,包括mRNA 以及一些在基因表达和发展过程中起调控作用的非编码RNA(ncRNA),例如转运RNA、核糖体RNA、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)及微小RNA(miRNA)等[7]。转录组包含了特定组织细胞类型、特定发育阶段及特定生理或病理条件下基因组转录的所有RNA的完整信息[8]。转录组分析为揭示触发人类疾病的关键生物过程提供了有利的证据,不仅有助于发现疾病发生发展的潜在机制,更能为疾病的分子诊断和临床治疗提供新方向[9]。

1.2 转录组学技术

转录组学技术经过不断的发展革新,目前主要包括微阵列基因芯片技术和转录组测序技术。前者以杂交技术为基础,利用目标RNA与标记探针杂交进行定性、定量分析,检测细胞基因组中基因表达水平,但因其杂交背景高噪音,无法检测出低丰度基因,仅适用于已知序列基因片段检测,在新基因的探索方面存在一定局限性[10]。基于测序技术的转录组测序技术目前已更迭到第三代,第一代的Suger测序和第二代RNA测序(RNA-seq)技术是将待测样本中mRNA片段反转录后进行测序,发展到第三代的单细胞测序技术已经可以对RNA全长进行直接测序分析[11],转录组分析由此进入一个高通量、高灵敏度、高精确性和低成本的新时代。目前,转录组学技术在新基因发掘[12]、基因差异表达[13]、分子生物标志物筛选[14]及中医药作用机制研究[15]等方面均有广泛应用。

2 转录组学在干眼研究中的应用

2.1 转录组学在干眼发病机制研究中的应用

目前人们普遍认为泪液高渗及眼表炎症损伤是导致干眼发生的主要因素,但仍未完全阐明其发病的核心机制。转录组学技术对于lncRNA、circRNA和miRNA等ncRNA在干眼相关基因调控中的研究取得了突破性进展,有助于认识干眼发生、发展过程中关键基因的调控规律,为干眼发病的复杂分子机制研究提供新方向。

2.1.1 lncRNA

lncRNA是长度大于 200个核苷酸且无法翻译成蛋白质的功能性RNA分子,起到调控基因表达的作用,lncRNA通常直接或间接参与各种生物过程和信号通路,其强大的多功能调节网络可能与干眼的发生相关[16]。研究证明,lncRNA MIAT是Caspase-1依赖性细胞焦亡及凋亡的关键介质,对细胞活力和细胞增殖呈负调控作用,参与高渗应激诱导下干眼患者角膜上皮细胞的炎症反应[17]。Yang等[18]利用全转录组测序技术分析了干眼小鼠lncRNA表达谱,发现了3353个差异表达的lncRNA,其中Chrnb2和Gabarap12变化最显著;该研究结果还表明神经活性配体-受体相互作用信号通路是干眼发病中最重要的通路,证实此信号通路是通过分泌神经递质参与干眼的炎症损伤过程。Tang等[19]通过微阵列技术检测并分析了干眼小鼠角膜上皮细胞中lncRNA及mRNA的表达情况,构建了lncRNA-miRNA-mRNA网络,得到差异基因的表达谱;他们推测NONMMUT047964.2可能通过调控miR-671-5p/Egr-1轴在干眼眼表炎症损伤过程中发挥重要作用。

2.1.2 circRNA

circRNA是一类具有多种生物学功能的新型ncRNA,可招募其他类型RNA,并通过与miRNA的结合,影响特定mRNA转录及翻译[20]。它们能直接调节基因表达及表观遗传修饰,circRNA表达失调可导致眼部疾病的发生[21]。有研究采用RNA-seq技术发现,circRNA(hsa-circRNA-001264、hsa-circRNA-104121和hsa-circRNA-045355)可能通过与下游miRNA结合,在原发性干燥综合征的发病中发挥潜在作用[22]。Liu等[23]通过高通量转录组测序及生物信息学综合技术对水通道蛋白5敲除干眼小鼠泪腺组织进行分析,发现了差异表达的30个circRNA和515个mRNA;在对其中的circRNA进行GO分析和KEGG分析后,又发现上调circRNA主要参与RNA磷酸二酯酶及核糖核酸酶活性调节,下调circRNA主要参与高压门控钙通道活性的正调节等。这些证据表明,水通道蛋白5的缺乏可能导致circRNA的差异表达,进而调控与吞噬体相关的circRNA-miRNA-mRNA网络,导致干眼发生。

2.1.3 miRNA

miRNA是目前研究最广泛的一类内源性ncRNA,可调节多种生物基因组的表达。近年来,已有研究证实,miRNA通过与其靶基因mRNA的3’非编码区碱基互补配对阻断mRNA翻译,从而抑制蛋白质的合成[24]。Pucker等[25]对人体泪液中的细胞外囊泡进行RNA测序后,明确了这些囊泡中含有与炎症相关的差异性表达miRNA,其中9种在干眼患者泪液中表达上调,这提示细胞外囊泡内的miRNA可能是促进干眼炎症反应分子机制中的重要环节。Kim等[26]同样也证明了miRNA在干燥综合征患者泪液中存在差异性表达,并阐明miRNA可能通过调节免疫细胞的发育及分化参与干燥综合征的发病。这些发现有望对干眼的病理机制作出解释。

2.2 转录组学在干眼诊断中的应用

干眼相关差异性表达基因的转录组学研究,有望发现潜在的分子生物标志物,作为诊断干眼的重要辅助手段,为干眼的进一步研究和临床诊断提供科学依据。

2.2.1 干眼差异性表达基因

同一生物体的细胞具有几乎相同的基因型,但大量的证据表明细胞间存在差异表达的基因[27],转录组学技术可分析并筛选出与干眼相关的差异性表达基因。Kessal等[28]通过对东莨菪碱诱导干眼小鼠模型(EDE-1)及泪腺切除干眼小鼠模型(EDE-2)进行转录组学分析,发现两组模型鼠在角膜(13个)及结膜(6个)中只有少数共同表达的基因,而EDE-1(角膜55个,结膜37个)和EDE-2(角膜51个,结膜65个)存在多个差异性表达基因。另一项研究[29]利用RNA-seq技术分析老年(2岁)和年轻(3个月)C57BL/6小鼠睑板腺转录组中的差异性表达基因,发现77个基因在年轻小鼠中高表达,418个基因在老年小鼠中高表达。这些差异表明不同的细胞信号信息都有其特定的基因调节。

2.2.2 干眼分子生物标志物

目前在干眼临床诊断及监测中,患者主观症状及客观检查是评估干眼最主要的指标,然而这些指标缺乏特异性、灵敏性及明显的相关性,常导致诊疗的延误。随着转录组学技术的快速发展以及对干眼研究的不断深入,干眼差异表达产物中越来越多的分子生物标志物被发现,可作为诊断干眼的重要辅助方法,指导干眼治疗。

我国的一项研究采用微阵列基因芯片技术初步分析了干眼患者泪液中miRNA的表达谱,发现健康人和干眼患者间存在32个差异性表达的miRNA,其中4个上调,28个下调,最终明确了泪液中的3个miRNA(miR-450b-5p、miR-1283和miR-3671)表达水平与干眼的严重程度显著相关,其结果进一步表明,通过检测泪液中的miRNA表达可作为诊断干眼的分子生物标志物,对干眼的无创性鉴别诊断具有潜在意义,并对评估角膜损伤风险具有重要价值[30]。Corrales等[31]第一个提出将膜相关黏蛋白MUC1作为干眼诊断标志物;在该研究中,中度至重度干眼患者结膜上皮中MUC1、MUC2、MUC4和MUC5AC的表达水平均较健康受试者群体显著降低,其中,MUC1在所有测试的基因中表现出最大的灵敏度(83.3%)和特异度(87.5%),将MUC1作为干眼诊断标志物不仅提高了诊断的准确性,而且有助于开发治疗干眼的有效药物。

2.3 转录组学在干眼治疗中的应用

目前临床上主要应用人工泪液暂时缓解干眼患者的眼表不适症状,无法有效根治干眼,转录组学技术有望为干眼的临床治疗提供新思路及新靶点。Daull等[32]通过对环孢霉素A治疗的干眼小鼠进行转录组学分析,发现环孢霉素A可显著调节干眼相关基因表达谱,并可通过调节炎症反应有效减轻干眼小鼠角膜上皮病变。有趣的是,该团队发现在干眼的发生过程中,角膜、结膜和泪腺存在不同的炎症基因表达,说明干眼对角膜、结膜和泪腺的转录组学特征有不同的影响。Wang等[33]采用GO和RNA-seq对人角膜上皮细胞及小鼠角膜进行分析,发现褪黑素对血红素氧合酶-1具有显著的调节作用,可以通过减少过量活性氧的产生维持线粒体功能,保护角膜上皮细胞免受氧化损伤,并可减轻炎症反应。最近的一项研究表明,miR-328的过度表达可通过抑制角膜细胞增殖促进其凋亡,最终导致干眼的发生,而抗miR-328寡核苷酸可促进实验动物角膜再上皮化,减少角膜上皮细胞及基质细胞的凋亡,并可有效防止睑板腺的阻塞,该团队推测抗miR-328寡核苷酸可能是干眼的一种新的治疗方法[34]。

泪腺导管类器官及生物工程替代物的发现有望指导干眼的治疗。Bannier等[35]通过建立来源于小鼠及人类组织的泪腺导管类器官,并对其进行单细胞测序,揭示了泪腺上皮(LGE)细胞的异质性,并表明泪腺导管类器官中的神经递质暴露后会产生水液分泌,提示泪腺导管类器官可以用作干眼泪液诱导剂的筛选平台。Hirayama等[36]同时对小鼠和人的泪腺组织进行微阵列分析,确定了LGE细胞的基因表达谱,发现其中富集的3种特异性转录因子(PAX6、FOXC1和SIX1)过表达可促进人胚胎干细胞分化为LGE样细胞;这是首次从人类细胞中诱导出LGE样细胞,这项研究提示了从人类多能干细胞再生LGE细胞的可能性。这些发现是未来干眼功能性生物工程器官替代治疗的第一步,将为人类干眼提供一种可能的治疗策略。在此之前,该团队还证实了生物工程泪腺替代物可以恢复泪腺的生理功能,通过将生物工程泪腺体胚芽原位植入成人眼眶外的导管,可产生足够量的泪液保护眼表[37]。

3 结束语

干眼的致病机制复杂,治疗棘手,转录组学技术可对干眼差异表达基因进行筛选分析,鉴定相关特异性生物标志物,从分子层面阐明干眼的发生发展机制,为干眼的早期诊断及精准治疗提供全新的思路。虽然转录组学在干眼研究领域的应用前景广阔,但目前仍面临诸多挑战。首先,转录组学分析主要应用于干眼的基础研究,尚未在临床中推广,研究仍处于起步阶段,如何将其发展完善并广泛应用于临床实践是目前亟待解决的难题之一。其次,单一的转录组学方法难以全面阐述干眼致病机制,有必要联合代谢组学、蛋白组学等多组学进行整合分析,加深对干眼关键功能基因表达及调控规律的了解,实现干眼的精准诊疗。相信转录组学技术的广泛应用将极大地推动干眼研究领域的进步。