糖尿病视网膜病变的生物治疗研究最新进展△

2024-05-19韩笑言

眼科新进展 2024年4期

李朵韩笑言蒋沁

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一,也是工作年龄成年人失明的主要原因。国际糖尿病联盟在2019年统计全球糖尿病的患病人数为4.63亿,预计2045年患病人数将达到7.00亿。而在糖尿病患者中,DR的全球患病率高达三分之一。由此可见,DR已经成为一个全球性的公共卫生问题[1-2]。在DR发展过程中,代谢失调、氧化应激和炎症等病理过程发挥着重要作用,其可损伤视网膜的神经血管功能,参与DR的发病[3]。目前,DR的治疗包括抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗、激光光凝、手术等。然而,这些方式无法逆转糖尿病视网膜的病理状态,且有创手术和重复的药物注射也可能带来不同程度的副作用。因此,靶向治疗、基因治疗、免疫治疗及细胞治疗等多种生物治疗方式被越来越多的探索和研究,旨在实现长期有效的逆转疾病[4]。本文将简要介绍DR的病理生理机制以及目前其相关的生物治疗方面的研究进展。

1 DR的病理生理机制

1.1 代谢异常、氧化应激及炎症反应

高血糖在DR发生发展过程中有着重要的作用,首先,血糖升高导致了多种代谢途径的异常,包括己糖胺途径的激活、晚期糖基化终末产物积累、多元醇途径的激活、蛋白激酶C(PKC)途径的激活、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶激活和肾素-血管紧张素醛固酮系统激活等[5],这些途径可驱动代谢功能障碍,导致视网膜结构和功能的损伤,进而引起DR的形成和进展。不仅如此,高血糖诱导的代谢功能障碍可以导致过度的氧化应激,这是DR形成的另一个关键环节。氧化应激可以激活与DR进展相关的级联反应,同时氧化应激也会进一步加重代谢功能障碍,从而形成恶性循环[6]。氧化应激过程中积累的过多的活性氧可以诱导线粒体损伤、细胞凋亡,进一步导致血管通透性增加、视网膜细胞功能障碍等一系列病理过程[3]。此外,炎症也是DR发生和进展的重要驱动因素,其与代谢失调和过度氧化应激有着内在的联系。在DR患者中可检测到细胞因子升高、白细胞瘀滞、补体和小胶质细胞激活等炎症特征,其中白细胞瘀滞是其发病的关键过程。有研究发现糖尿病大鼠和患者的白细胞黏附性增强,白细胞β2整合素表达增加,细胞内黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1和E-选择素水平增加,且与DR的严重程度相关。且在高血糖压力下,VEGF、单核细胞趋化蛋白-1、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌增加,随后这些分泌因子可通过产生促炎因子进而放大炎症反应[7]。

1.2 神经血管单元功能障碍

目前普遍的观点认为视网膜神经血管单元(NVU)完整性的进行性丧失是疾病发病机制中的一个重要因素[8]。NVU由神经细胞(即神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞)、胶质细胞(Müller细胞、星形胶质细胞)、免疫细胞(小胶质细胞、血管周围巨噬细胞)和血管细胞(内皮细胞、周细胞)组成,这些细胞紧密沟通,维持内层血-视网膜屏障的完整,从而维持整个视网膜的功能。当NVU的完整性发生损伤,则会引起以血管基底膜增厚、内皮细胞与周细胞功能障碍等为特征的微血管病变和以神经元凋亡和反应性胶质化为特征的神经退行性病变,进而导致视网膜疾病的发生发展[9]。

2 生物治疗

生物治疗是一个广泛的概念,涉及一切应用生物大分子进行治疗的方法,种类十分繁多复杂,且各种分类之间互相交叉,界限尚不十分明确。生物治疗可大致分为非细胞治疗和细胞治疗,其中非细胞治疗又包含靶向治疗、基因治疗、免疫治疗、多肽或蛋白质疫苗等。

2.1 非细胞治疗

2.1.1 靶向治疗

靶向治疗是在细胞分子水平上对致病蛋白等化学分子进行特定结合的治疗方式。在过去的研究中,已经确定了一系列与DR发病相关的蛋白分子、信号通路、炎症因子等。针对这些不同的致病位点,靶向治疗也分为不同的方向。

2.1.1.1 靶向蛋白分子

有多种蛋白分子参与DR的发病机制,因此针对不同的蛋白分子位点也有多种治疗化合物。在抑制血管新生方面,抗VEGF药物目前已经被广泛应用于临床,其中常用的药物包括重组人源化单克隆抗体如贝伐珠单抗和雷珠单抗,以及人源化重组融合蛋白类,如阿柏西普和康柏西普等。最新研究发现,一种双特异性单克隆抗体——法瑞西单抗,其可同时抑制VEGF-A和血管生成素-2以及酪氨酸激酶,该药具有更好的血管稳定性从而减少血管渗漏。同时,法瑞西单抗于2022年1月在美国获得批准用于治疗糖尿病性黄斑水肿患者[10-11]。此外,也有研究发现可溶性信号素4D(sSema4D)蛋白是一种强烈的促血管生成和渗出因子,且sSema4D/PlexinB1-mDIA1信号可以影响内皮细胞迁移、增殖,并调控内皮细胞钙黏蛋白磷酸化和周细胞神经钙黏素内化,进而导致血管渗漏。基于此,智能超分子多肽滴眼液通过特异性识别和捕获sSema4D,使sSema4D的受体介导的生物学效应受到抑制,从而显著缓解DR中病理性视网膜血管新生和渗出。同时,此研究也发现智能超分子多肽滴眼液和抗VEGF注射联合使用显示出更好的治疗效果[12]。此类靶点还有很多,比如靶向膜联蛋白A2、分泌粒蛋白III以及血管生成和纤维化双诱导因子Gremlin1等[13-15],这些靶点在治疗DR方面发挥着不同程度的作用。

2.1.1.2 靶向细胞信号转导通路

细胞信号转导通路在DR发病机制中的作用一直是研究的重点和热点。一直以来DR信号通路的研究主要集中在PKC通路、Wnt通路、Notch通路等[16]。既往有研究报道了PKC抑制剂对缓解DR视力下降有一定的潜力[17],以及内源性Wnt拮抗剂人组织激肽释放酶结合蛋白通过抑制经典Wnt信号在DR小鼠模型中发挥了抗血管生成和抗神经炎症作用[18]。然而DR的发病机制复杂,涉及多种信号通路,这便要求我们继续探索DR发病相关的通路,以寻求新的治疗靶点。最新有研究发现,P2X7/NLRP3通路通过ATP反馈环放大炎症反应,促进视网膜内皮细胞的炎症反应、焦亡和凋亡。而3TC,一种核苷类逆转录酶抑制剂可以靶向P2X7/NLRP3信号通路从而对抗这种炎症、凋亡和焦亡[19]。此外,也有研究发现,由JWA蛋白7个氨基酸组成的优化片段JP1可以通过抑制小胶质细胞中的ROS/NF-κB信号转导来抵抗氧化应激和炎症,并通过调节血管内皮细胞中的MEK1/2-SP1-整合素αVβ3和TRIM25-SP1-MMP2轴来抵抗血管生成,同时此研究也发现在激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠腹腔注射异硫氰酸荧光素(FITC)标记的JP1(FITC-JP1)或FITC后,与FITC组相比,FITC-JP1组小鼠CNV病灶中的荧光强度显著增加,证实JP1可以穿透血-视网膜屏障靶向CNV病灶,因此,推测JP1可用于设计新型的CNV或DR靶向治疗剂,可能取代目前的侵入性眼内注射性治疗[20]。综上,对信号通路的探讨及其靶向干预不仅能够探索信号通路对疾病的作用,同时能够发现相关抑制剂或激动剂在控制疾病方面的疗效,从而将基础研究成果转化为临床应用。

2.1.1.3 靶向炎症因子

炎症也是DR发生和进展的重要驱动因素。越来越多的证据证实多种炎症因子(如IL-1β、单核细胞趋化蛋白-1、TNF-α等)在DR患者的玻璃体和视网膜中增加。这些炎症因子与VEGF等生长因子一起,导致血-视网膜屏障破坏、血管损伤和神经炎症以及病理性血管生成[21]。靶向这些炎症因子的新疗法具有抑制视网膜炎症和阻止DR进展的潜力。其中已经有研究发现白细胞介素-17A(IL-17A)是I型糖尿病小鼠中DR的主要炎性前体[22]。随后又有研究表明IL-17A在II型糖尿病诱导的DR中发挥类似于在I型糖尿病中确定的病理作用。同时使用鼠IgG1单克隆抗IL-17A抗体靶向治疗,明确了抗IL-17A或许可以作为一种潜在的非增生型DR(NPDR)的新型治疗方法[23]。目前,许多靶向炎症相关分子的药物,如英夫利昔单抗、利菲格拉司特(SAR1118)、鲁米特(ALG1001)、卡那单抗、托珠单抗、EBI-031等已进入临床试验阶段,但后续大部分试验被终止或撤回,未达到主要终点。试验的局限性可能包括许多细胞因子参与了DR发病机制中的炎症、氧化应激和细胞凋亡,因此很难通过拮抗单个分子来治疗DR。虽然这些药物目前尚未在DR的治疗中被广泛使用,但是关于靶向炎症因子的研究有助于开发基于炎症机制治疗的联合治疗,如抗VEGF联合抗炎药物[21]。

2.1.2 基因治疗

基因治疗是一种通过编辑特定基因表达来达到治疗效果的干预措施。其目的是将遗传物质导入患者的细胞,以补偿有缺陷的基因或传递治疗性的转基因[24]。基因治疗有几种策略,包括基因扩增、基因特异性靶向以及基因组编辑[25]。目前针对DR的基因治疗研究主要采用基因特异性靶向治疗。

2.1.2.1 基因特异性靶向治疗

许多基因治疗都是基于对DR治疗显示出明显效果的药物,主要是抑制视网膜异常新生血管方面的药物,包括抗VEGF药物、内源性血管生成抑制剂及肾素-血管紧张素系统(RAS)相关药物等。目前临床上单独使用抗VEGF治疗可能会引起视网膜中结缔组织生长因子(CTGF)的上调,增加纤维化和牵拉性视网膜脱离的风险,因此有研究通过基因治疗减少CTGF的表达,用VEGF抗体和CTGF小干扰RNA双重干预,结果提示此联合治疗方法比单一抗VEGF治疗能更好地保存视网膜血管超微结构[26]。除此之外,许多实验也试图从细胞外和细胞内两方面干预眼内VEGF通路。已经有研究证明腺相关病毒(AAV)介导的细胞外VEGF受体1的可溶性剪接变体sFlt-1和细胞外抗VEGF受体Flt23k均可以降低VEGF水平从而达到抑制新生血管生成的作用[27-28]。另外,有研究表明基因治疗中引进内源性血管生成抑制剂可进一步增加治疗效果,如血管抑素、内皮抑素、钙网蛋白抗血管生成结构域等。如近几年有研究玻璃体注射慢病毒传递的血管抑素发现成功地减少90%的治疗动物的新生血管[29],以及在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型中玻璃体内注射AAV递送的钙网蛋白抗血管生成结构域可以显著减少CNV和视网膜新生血管[30]。同时,基因治疗也可结合针对RAS系统的药物,已经有研究发现血管紧张素转换酶抑制剂在治疗NPDR方面的有益效果。有研究者使用AAV2传递的血管紧张素转换酶2可预防及部分逆转链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠的视网膜病变[31]。

除了抑制视网膜中存在的异常血管外,DR的基因治疗也可以通过神经保护,预防视网膜血管功能障碍或减轻氧化应激等途径展开。这些研究包括通过AAV编码具有神经保护作用的因子,如脑源性神经营养因子、促红细胞生成素[32-33]、基因编码具有抗氧化应激作用的锰超氧化物歧化酶[34]、通过AAV8转导可以提高胰岛素抵抗的基因UCN2,来治疗糖尿病从而改善DR[35]。

2.1.2.2 小核酸药物

小核酸药物也是基因疗法之一,其由核苷酸组成,主要作用于细胞质的信使RNA(mRNA),通过碱基互补识别和抑制靶mRNA,实现对蛋白表达的调控,达到治疗疾病的目的。小核酸药物主要包括反义寡核苷酸 (ASO)、小干扰RNA、微小RNA、小激活RNA、mRNA、RNA适配等,由于其特异性强、靶点丰富、设计周期短等特点而受到科研人员的重视。近年来,诸多研究揭示了非编码RNA在DR发生发展中的重要作用,为小核酸药物的研发提供了理论支持[36]。有研究团队发现microRNA-29a (miR-29a)参与调控视网膜血管发育成熟,并对内皮细胞的增殖、迁移和成管能力具有抑制作用,同时也确定了血小板衍生生长因子C和几种细胞外基质基因是miR-29a参与调节眼部血管生成的下游靶标。此发现表明miR-29a或许可能是治疗新生血管性疾病的一个有前途的临床候选靶标[37]。随着RNA谱测序技术的广泛应用,越来越多非编码RNA被筛选出来,如miR-200b、miR-146a和miR-126等都被证明可能参与DR的发生[38]。此外, ASO,一种合成的单链核酸聚合物,可通过多种机制调节基因表达。近年来,ASO相关药物陆续被批准上市,如Viltepso、AMONDYS45等,被用于杜氏肌营养不良等遗传相关疾病,同时也在尝试治疗DR[39]。

2.1.3 免疫治疗

免疫治疗是指针对机体低下或亢进的免疫状态,人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。与其他生物治疗不同的是,免疫治疗靶向的不是致病位点,而是自身的免疫系统。近些年随着分子层面的研究以及抗炎治疗在DR中的积极效果,免疫失调已被越来越多认为参与了DR的发生发展。眼部的先天免疫系统是复杂的,由小胶质细胞,非小胶质细胞(血管周围巨噬细胞、持续性透明细胞、树突状细胞)以及补体系统构成[40]。靶向免疫系统,维持其稳定,或可延缓DR。

2.1.3.1 调节小胶质细胞

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻组织巨噬细胞。在静息状态下,小胶质细胞通过吞噬作用和控制低度炎症,帮助维持视网膜中的组织稳态。然而,高血糖引起的长期组织应激使小胶质细胞过度反应,并伴随促炎细胞因子和趋化因子的产生,导致慢性炎症[41]。因此调节小胶质细胞的反应性可被认为是治疗DR的一种可行策略。米诺环素,一种半合成的四环素类似物,通过抑制TNF-a、IL-1b、一氧化氮、环氧合酶和前列腺素的表达,对小胶质细胞表现出抗炎和抗凋亡特性。米诺环素还被发现可以显著减少外层视网膜中阿米巴样小胶质细胞的数量,并抑制转位蛋白(TSPO)的表达[42]。TSPO是一种反应性胶质化的生物标志物,研究发现反应性小胶质细胞表达TSPO,而TSPO可以调节小胶质细胞的炎症反应、吞噬作用和活性氧的分泌,增强视网膜血管生成[43]。因此,米诺环素可以从数量和功能上调节小胶质细胞,从而增加视网膜的稳态。此外,包括姜黄素、槲皮素和高良姜素在内的一些化合物是有效的小胶质细胞调节剂,它们在小鼠DR模型中的使用改善了疾病结果[44]。

2.1.3.2 调节性T细胞

调节性T细胞(Tregs) 是适应性免疫系统的一部分,可以降低免疫反应以维持免疫稳态。在糖尿病患者中,Tregs的作用常常会由于各种原因而被减弱,其中包括促炎细胞因子的异常产生以及转录因子Foxp3稳定性的减弱等[45]。因此,维持或者提高Tregs的质量或许可以成为DR的一种免疫治疗手段。其中,IL-35是IL-12家族的一种抗炎异源二聚体细胞因子,由IL-12a(p35)和Epstein-Barr病毒诱导基因3蛋白链组成,在Tregs的功能中发挥关键作用。其已被报道可以通过扩大Treg细胞群和阻止促炎性辅助性T 细胞17(Th17)的发展来发挥抗炎作用[46]。有临床研究发现,与对照组相比,DR患者玻璃体中IL-35的表达显著下调,而在离体研究中,IL-35给药对Th17有抑制作用,最终引起较少的炎症反应[47-48]。由此可见,通过IL-35来调节Tregs的功能从而起到抗炎的作用或许可以成为未来治疗DR的一种潜在治疗方式。此外转录因子Foxp3是Treg细胞的标志性分子,Foxp3必须是稳定的才可以充分发挥Treg细胞的功能[49],因此,通过维持Foxp3的稳定性从而提高Tregs的质量也可以成为一种治疗策略。如有研究正在通过CRISPR-Cas9 RNP技术针对参与Foxp3稳定性的潜在基因进行分析,希望可以在人Treg细胞中发现新的转录调控因子和下游基因网络以用于DR的靶向免疫治疗[50]。除此之外,应用间充质干细胞体外扩增Treg细胞群也可起到治疗作用[51]。

2.1.3.3 抑制补体系统

补体系统在视网膜稳态中发挥着至关重要的作用。研究通过评估主要补体蛋白包括C3、C1q、C4b,补体因子B和补体因子H及其经典和替代途径的活化片段在增生型DR(PDR)患者和对照组玻璃体和血清样本中的水平,发现在PDR患者的玻璃体中C3及其活化片段C3bα’显著增加,同时伴随着补体因子H的相应上调,这证实了PDR中替代补体途径的激活增加[52]。因此,靶向抑制补体激活可以通过减少潜在的神经炎症和异常血管生成成为DR的有效治疗方法。然而这方面的研究还不是很多,仍需要进一步深入研究。

2.1.4 其他

相比上述的靶向特定位点的治疗,针对整体代谢异常状态的治疗也受到了研究者关注。如针对钠-葡萄糖转运体2(SGLT2)的抑制剂(恩格列净,达格列净等)目前用于2型糖尿病的治疗且已被证明可以降低心血管和肾脏事件的风险。然而它们对DR的潜在有益作用研究较少,但有研究者通过动物实验发现药物处理的小鼠不仅表现出健康的体重增加和明显的葡萄糖耐量,同时也减少了视网膜微血管和神经异常的发育,增加了有益生长因子成纤维细胞生长因子21[53-54]。也有研究发现降脂、降压、抗凝/抗血小板治疗等或许都对延缓DR发展有作用,其中的具体机制还有待研究[55-57]。

多肽疫苗也是一种治疗措施,肾素前体被认为是预防DR的理想靶分子。在没有抑制肾素原激活的药物问世前,针对肾素前体的疫苗接种被证实是对抗2型DR早期病理改变的有效和安全的措施[58]。除此之外,一些药物如姜黄素、驻景丸、白藜芦醇、十六酰胺乙醇和褪黑素等通过抗炎和抗增生作用调节DR的病理生理变化,也作为DR的一种补充治疗[21,59-60]。

2.2 细胞治疗

DR发展过程中存在着细胞凋亡和功能障碍,利用干/祖细胞进行细胞替代也成为一种治疗方法。内皮祖细胞(EPCs)、间充质干细胞(MSCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)和其他类型的干细胞都被证明是治疗DR的潜在细胞替代疗法[61]。

2.2.1 EPCs

EPCs是血管内皮细胞的前体细胞,在生理或病理因素刺激下,可从骨髓动员到外周血进而参与损伤血管的修复[62]。其表面标志物为CD34+、CD133+以及VEGF受体2[63]。EPCs有两个亚群:循环血管生成细胞(CACs)和内皮集落形成细胞(ECFCs)。其中CACs可以通过旁分泌的方式促进血管生成[64],而ECFCs则能够直接整合到发育中的血管并在体外形成管状结构,因此具有良好的治疗潜力。在糖尿病条件下,患者外周血中ECFCs和CACs的数量下降及功能失调,导致血管修复受损和微血管病变进展[65]。因此,人们提出CACs和ECFCs可以通过直接整合到新生血管或旁分泌血管生成效应来促进血管修复。具体的治疗策略包括EPCs细胞移植、EPCs与其他细胞联合移植以及内源性EPCs调节激活[66]。有研究在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中玻璃体内注射健康人骨髓或外周血来源的人CD34+干细胞,发现治疗组视网膜浅层毛细血管丛的血管密度和血管长度密度显著高于对照组,此研究表明CD34+干细胞可快速直接归巢并整合到视网膜血管受损部位并对其产生保护作用[67]。此外MSCs可以通过CXC趋化因子受体2和CXC趋化因子受体4之间的正反馈环路吸附内皮祖细胞[68],因此可以作为一种联合移植的策略。EPCs治疗还可以保护和重新激活内源性干/祖细胞和内源性修复机制,使哺乳动物的视网膜能够自我修复。这类治疗可能耗时更短,免疫排斥等并发症更少。目前已经明确了几种可能靶向激活内源性修复机制的途径,但仍需要进一步的研究来证实其潜在的临床应用价值[69]。

2.2.2 MSCs

MSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞,其可从骨髓、脂肪组织、牙髓、胎盘、外周血和脐带血等多种组织中分离得到[70]。MSCs来源广泛,具有旁分泌和营养潜能,并且免疫原性低以及拥有强大的分化潜能[71],因此成为治疗多种疾病的细胞疗法中最具有潜力和前景的手段之一。 MSCs的主要治疗作用方式是旁分泌,通过分泌营养因子和细胞因子发挥神经保护、血管生成、抗炎和免疫调节作用[72]。而最近几年,相关研究表明在局部距离和短暂存活的情况下,MSCs最有可能将营养介质包装成细胞外囊泡(外泌体、微囊泡)进行递送[73-74],如最新有研究发现MSCs来源的小胞外囊泡可以通过递送miR-22-3p抑制NLRP3炎症小体的激活从而减轻DR[75]。MSCs中重要的一种类型:脂肪干细胞(ASCs)功能和表型上类似于脂肪组织中微血管的周细胞[76],因此,有研究员将人视网膜内皮细胞(HRECs)与ASCs和周细胞样(P)-ASCs在高糖条件下共培养并进行Western blot、免疫荧光染色和ELISA检测,结果发现在高糖的刺激下与HRECs共同培养的 P-ASCs的细胞膜磷脂酶 A2 活性和前列腺素 E2 释放量显著降低并且其培养基中VEGF-A的水平降低。该实验突出了自体分化的ASCs在未来基于细胞治疗的临床应用中抵抗DR诱导的损伤的潜力[77]。此外,MSCs的低免疫原性使MSCs具有逃避CD4细胞免疫识别的能力并且可能在异体环境中存活,这便为细胞移植治疗带来巨大的优势。

2.2.3 iPSCs

iPSCs是来源于成熟细胞,通过逆转录病毒技术和表达重编程因子使其恢复多能性的一种细胞类型。Gil等[78]发现人iPSCs可以分化为具有KDR+ CD56+ APLNR+(KNA+)表达特征的特定中胚层亚群。KNA+细胞具有较高的克隆增殖潜能,将KNA+细胞植入非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠背部皮下,并注射到2型糖尿病小鼠的玻璃体中,KNA+细胞可特异性分化为ECFCs,用来修复血管功能障碍的视网膜。这些结果证明了iPSCs可以通过恢复小鼠的灌注和纠正血管功能障碍起到保护视网膜的作用。除了分化为内皮前体细胞和周细胞以促进血管恢复外,iPSCs技术也可用于修复视网膜的其他细胞,拥有巨大的潜力。

从全球范围来看,目前的权威研究主要集中于干细胞治疗DR的基础研究。尽管如此,近年来也有一些临床试验陆续注册进行[79]。在一项正在进行的试验中,玻璃体内注射CD34+骨髓MSCs被用于治疗DR并被证实是可行和耐受性良好的,值得进一步探索[80]。目前而言,基于干细胞治疗DR的临床试验主要集中在EPCs、骨髓MSCs、造血干细胞以及人iPSCs,尽管现有临床研究质量较低,证据级别不足,其研究结果尚未被临床广泛接受,但是未来很可能会出现高质量的临床证据,以促进临床转化。