重视视网膜下注射技术的临床应用△

万光明 王明阳

视网膜下腔是位于视网膜色素上皮(RPE)层和感光细胞层之间的潜在腔隙。视网膜下注射是将治疗药物输送到视网膜下腔的一种给药方式。虽然玻璃体内注射是目前大多数眼底疾病的常用给药方式,但受限于内界膜和Müller 细胞的屏障效应,药物注入玻璃体后对RPE细胞和感光细胞等的作用有限,使其治疗效果受到影响[1]。而视网膜下注射使药物直接进入视网膜下腔,接触感光细胞层和RPE层,能更直接地发挥作用[1]。视网膜下注射技术起始于20世纪90年代,有人将含有绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体由巩膜途径注射到小鼠视网膜下腔中,观察到基因在RPE细胞中的有效表达,初步证实视网膜下注射的可行性[2]。随着医疗技术的进步与眼科手术器械的不断更新迭代,最初使用的33G针头现在已被专用的38G和41G视网膜下注射针头取代,视网膜下注射技术趋于成熟并达到高度安全和可靠。近年来,视网膜下注射技术已成为重要的眼底给药方式之一,在多种眼底疾病的药物及手术治疗中发挥着越来越显著的作用[3-5]。

1 视网膜下注射的临床应用

1.1 基因治疗

遗传性视网膜疾病(IRD)是由遗传缺陷引起的、以RPE细胞和光感受器细胞进行性退化为特征的一类遗传性眼病,具有高度临床和遗传学异质性,主要包括视网膜色素变性、Leber遗传性视神经病变(LHON)、 Leber先天性黑矇(LCA)、青少年黄斑营养不良(Stargardt病)、先天性无脉络膜症(CHM)等50余种类型[6]。基因治疗是极具前景的一种治疗方式,越来越多的IRD基因治疗方法正处于基础研究和临床试验中。以病毒载体或非病毒载体介导的基因替代疗法是其中一种重要的治疗方式,它利用病毒或非病毒载体将特定基因拷贝递送到该基因缺陷患者的视网膜细胞中,从而帮助患者提高或恢复视功能[7]。通过视网膜下注射的方式进行载体与目标基因的递送是目前首选的给药途径,相较于玻璃体内注射和脉络膜上腔注射等其他给药方式,视网膜下注射递送效率更高,加之视网膜下腔具有免疫豁免,更有利于降低机体对病毒的潜在免疫反应[8-9]。2017年,美国食品和药品管理局批准Luxturna®用于治疗RPE65基因突变相关的视网膜变性疾病,以单剂量视网膜下注射的方式进行基因递送,这是第一个直接纠正缺陷基因的疗法,使得基因治疗在眼科领域迅速发展[10]。此后,多种基因突变相关IRD,如LHON、LCA、CHM、Stargardt病等也开始了视网膜下注射基因治疗的研究与临床试验[11-13]。

除IRD外,以视网膜下注射作为递送方式的基因治疗也逐渐应用到与单一遗传缺陷无关的眼底疾病中,如年龄相关性黄斑变性(AMD)。RGX-314和ADVM-022是以腺相关病毒为载体携带编码血管内皮生长因子(VEGF)单抗基因片段的基因治疗药物,用以抑制新生血管形成、渗漏。在单次进行视网膜下注射RGX-314和ADVM-022治疗新生血管性 AMD的临床试验中,人们观察到RGX-314和ADVM-022具有良好的安全性和有效性,表现出持久的抗VEGF效应,并显著降低了VEGF抗体类药物的玻璃体内注射频率[14-15]。目前的研究已经表明,视网膜下注射已成为基因替代治疗中不可或缺的一种给药途径。

1.2 细胞治疗

视网膜退行性疾病是以RPE细胞和光感受器细胞进行性减少为主要特征的一大类眼病,主要包括AMD、IRD、糖尿病视网膜病变、黄斑营养不良等,可导致视力进行性下降甚至失明,临床治疗主要是对症及缓解疾病进展。细胞治疗在视网膜退行性疾病的治疗中具有很大的应用前景,通过视网膜下细胞移植,使具有特定功能的细胞迁移到视网膜层并存活,刺激视网膜细胞再生或补充,替代并修复丢失或受损的视网膜细胞以恢复视网膜功能,达到治疗目的[16-17]。由于视网膜下腔相对于玻璃体腔具有独特的免疫赦免作用,视网膜下注射成为细胞治疗的优选给药方式,是一个直接、有效和安全的移植途径[18]。移植治疗所采用的细胞通常包括自体或异体细胞、干细胞以及干细胞来源的视网膜前体细胞或成熟细胞。

目前已开展了十余项视网膜下注射细胞移植疗法的临床试验,用于治疗视网膜退行性疾病,包括AMD和IRD等。其中,美国先进细胞技术公司率先启动了胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮(embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial,ESC-RPE)细胞视网膜下移植治疗AMD的临床研究。随访中,未发现移植的ESC-RPE细胞异常增殖和患者出现自身的免疫排斥反应,同时患者的视力均略有提高[19]。我国ESC-RPE细胞移植治疗干性AMD的临床研究也居世界前沿,目前国内由中国科学院动物研究所和郑州大学第一附属医院眼科及首都医科大学附属北京同仁医院联合开展的ESC-RPE细胞视网膜下腔移植治疗干性AMD的相关临床试验已经取得阶段性成果(注册号:ChiCTR-OCB-15007054)[20-21]。

1.3 黄斑下出血的辅助治疗

黄斑下出血(SMH)是一种眼底病变,可能导致视力下降甚至失明。出血的原因可能全身性病变和局部病变。全身性病变如糖尿病视网膜病变、高血压性视网膜病变、肾病性视网膜病变等,而局部病变则主要指的是眼底本身的病变,如视网膜中央或分支静脉阻塞、视网膜血管炎、视网膜脉络膜炎等[22]。SMH可继发于多种眼部病理因素,如湿性AMD、息肉状脉络血管病变、眼外伤、病理性近视或视网膜微动脉瘤破裂等[22]。尽早清除积血,减少血凝块对黄斑的损害是治疗SMH的关键。

目前视网膜下注射组织型纤溶酶原激活物(t-PA)已广泛应用于SMH的手术治疗中,术中应用视网膜下注射针头于黄斑区视网膜下出血灶的合适部位穿刺,并在视网膜下腔注入t-PA,可促进血凝块溶解,有助于积血的排出,还可降低血栓在清除过程中对光感受器造成医源性损伤的风险[23-24]。视网膜下注射的部位通常选择在远离黄斑中心凹的出血区域视网膜下间隙。另外,尽管视网膜下注射t-PA可直接溶解血凝块,但视网膜下的积血仍可对视网膜产生损伤,因此通常需要联合玻璃体切除并借助气体的顶压作用,将溶解的积血驱散出黄斑区并促进其吸收。

1.4 其他治疗

由于视网膜下注射针头较细,对视网膜及病灶周围组织损伤较小,针头拔出后视网膜穿刺孔自行闭合,一般无须激光等特殊处理,因而在临床中也可用于视网膜下残留重水的取出。玻璃体切除手术后视网膜下残留重水严重影响患眼视力,尽早取出视网膜下残留重水小滴有助于视功能的恢复[25]。García-Arumí等[26]采用带有抽吸系统的50G针头进入视网膜下间隙,抽吸视网膜下重水。万光明等[27]通过38G针头对3例视网膜下重水小滴残留患者进行处理,均成功取出残留重水小滴,术后视网膜复位良好。应用视网膜下注射针头取出视网膜下重水拓展了视网膜下注射技术的应用范围。

此外,视网膜下注射技术正在用于多种眼底疾病的手术治疗中。如通过在黄斑区不同象限中利用平衡盐溶液(BSS)预制视网膜下水泡,诱导有限的视网膜脱离来治疗黄斑皱褶,或解除感光细胞层和RPE层之间发生的二次粘连,甚至可使难治性和复发性黄斑裂孔闭合[3,28]。视网膜下注射BSS还有助于促进顽固性黄斑水肿的吸收[29]。通过视网膜血管注射t-PA等药物,可帮助视网膜动脉阻塞患者改善其视力预后[30]。

2 视网膜下注射的方法与技巧

视网膜下注射的入路途径包括内路和外路,内路和外路视网膜下注射目前均有专用的注射针头可以选用。外路是经巩膜入路通过脉络膜到达视网膜下腔,这种途径不需要进入眼内,也不需要穿透玻璃体和视网膜。但目前临床使用较多的是内路途径。通常来说,经内路注射是在巩膜三切口的玻璃体切除手术中进行的。术中建立常规23G/25G/27G经睫状体平坦部玻璃体切割三通道,切除玻璃体后进一步确定具体的最佳注射部位,使用38G 及以上视网膜下微注射针头于视网膜下注射载体溶液或治疗药物[31]。注意在进入玻璃体腔之前,必须清除注射针头及注射器内任何气泡并确认针头的通透性。注射方法可以是手动注射或者机器辅助注射,手动注射通常是术者固定注射器和针头后由操作熟练的助手缓慢推动注射器进行视网膜下腔给药,机器辅助注射是通过使用玻璃体切割机的脚踏板控制注射压力和输注速度来进行自动化的视网膜下注射。机器辅助视网膜下注射具有精准压力缓慢注射等优点,但需应用微量自动注射器连接硅油管件,这些物品均需要额外的费用。而手动注射助手协助的方法也是安全、可行的。药物注射完毕后应停留针头数秒,以尽量减少液体反流入玻璃体腔。

视网膜下注射前对于注射位置的合理设计以及术中辅助工具的应用也很重要。术前通过对眼底和光学相干断层扫描图像分析评估,选择最佳的注射位置,尽量避开视网膜萎缩、视网膜前膜、视网膜血管等区域进入视网膜下腔,同时最大限度地提高功能效益。距黄斑中心凹大于2 PD的颞侧血管弓区域、视网膜病灶的升高区域是常选用的注射部位,可以最大限度地减少术中潜在的医源性视网膜损伤。术中进行视网膜下注射时,注射压力和进针深度的确定对保障整个注射过程的安全至关重要,所施加的注射压力必须大于神经视网膜与RPE层之间的黏附力。注射压力不宜过高,否则可能增加机械性视网膜损伤。研究显示,注射压力在12～18 PSI(1 PSI=6.895 kPa)时,视网膜整体结构表现较为稳定[32-33]。也有学者建议剥除内界膜,并将注射压力从12 PSI减至6 PSI,以便更安全地进针[34]。利用可调节压力的微量注射器或黏性流体控制系统有助于保证更加准确和稳定的药物注射量[35-36]。此外,术中还可通过光学相干断层扫描显示进针深度并观察视网膜的拉伸情况以及预制视网膜下水泡的情况,辅助视网膜下注射的顺利进行[37]。

对于RPE萎缩程度较轻、视网膜神经上皮层与RPE层较易分离的患者,可直接进行视网膜下注射,这样既可以提高注射成功率,也可尽量减少对组织的损伤。而对于干性AMD、视网膜色素变性及先天性无脉络膜症等患者,由于其RPE层与神经视网膜难以分离,可通过预制BSS视网膜下水泡,再进行视网膜下注射药物,以减轻进入视网膜下腔的阻力[31]。预制视网膜下水泡有助于观察针头的定位,保证注射过程中针头始终位于视网膜下。此外,预制水泡提供了一个缓冲区间,可降低药物反流至玻璃体腔中继发炎症反应的风险并可减少视网膜下注射期间药物的丢失。在基因治疗中,预制水泡还可通过稀释局部病毒载体的滴度,降低病毒载体毒性所带来的潜在风险[31]。需要注意的是,预制水泡的大小会影响输送至视网膜下腔的药物量,若预制水泡过大,可能无法使足量的药物递送入视网膜下腔,并会导致视网膜过度拉伸,增加黄斑裂孔形成的风险。此种情况下,术中辅助应用重水有助于减少黄斑裂孔形成,确保注射过程中视网膜下水泡缓慢形成,使中心凹区域的应力最小化[38]。对于是否需要剥除内界膜,由于视网膜下注射操作本身会造成局限性视网膜脱离,注射前也可不进行黄斑部内界膜的剥除,术毕注射孔也无须行激光封闭处理。

3 视网膜下注射的优势与风险

当进行玻璃体内注射时,药物可能在玻璃体腔中被稀释,使外层视网膜的药物剂量无法到达治疗浓度,而视网膜下注射使药物与感光细胞、RPE细胞直接接触并作用,在保证达到起效药物浓度的同时允许以小剂量进行视网膜下给药,药物作用时间也更长[39]。与玻璃体腔相比,视网膜下腔是一个更安全的区域,因为它在解剖学上是封闭的,同时具有免疫赦免特权,能够将免疫排斥与炎症风险最小化[39]。进行视网膜下注射的专用针头外径很细,对视网膜组织损伤较小,注射时安全、可靠,注射后视网膜穿刺孔部位可自闭愈合。这些优势使视网膜下注射成为眼科继玻璃体内注射后又一重要的给药途径。我们在视网膜下注射的临床操作实践中发现,对于一些透明玻璃体的患者,如果仅仅是为了视网膜下注射操作,经评估后甚至可不进行玻璃体切除或仅切除后极部玻璃体而直接进行视网膜下注射,这样可在保证注射操作顺利进行的前提下最大程度地减少对眼内内环境的干扰。然而,视网膜下注射技术也具有一定的风险并可能引起并发症,如持续性视网膜脱离、视网膜出血,注射部位视网膜脉络膜萎缩,眼内炎等;此外,进针过深可导致脉络膜上腔给药、脉络膜出血;进针过浅可导致视网膜劈裂;注射量及注射压力控制不当可引起黄斑裂孔、视网膜撕裂;若注射药物或病毒载体反流入玻璃体腔还可引发免疫反应[40-42]。为了避免术中及术后出现上述并发症,在视网膜下注射前应进行严格的手术设计与规划,术中操作做到精准、稳定,术后注意观察患者的眼底情况,若出现并发症应给予及时处理。

4 结束语

视网膜下注射是一种极具潜力的给药方式,目前对于注射方法的标准与流程也在不断改进与规范,这将进一步提高治疗的安全性和有效性。当前,多项通过视网膜下注射方式进行基因治疗或干细胞治疗视网膜退行性病变的临床试验正在开展,视网膜下注射技术的临床应用范围也在不断拓宽,今后也会使更多的患者受益。同时,对于视网膜下注射可能出现的风险与并发症也需提高警惕,注意完善术前准备,术中规范操作,出现并发症时应及时干预与治疗。