温度对鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF- 1 的影响

张雨晴，夏 晴（并列一作），喻 峰，吴 军*

（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，上海）

细胞培养技术在生物医学研究领域中扮演着至关重要的角色，为科学家们提供了一个可控制、可重复、且具有高度可变性的体外实验平台[1]。在这个背景下，鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1 作为一种重要的细胞系，已在禽流感病毒和其他禽源病毒的研究中展现出其独特的应用价值，俨然已经成为禽源病毒学研究、疫苗开发以及宿主细胞反应等领域的理想工具[2-4]。

近年来，随着对禽流感等禽类病毒感染机制和生物学特性深入研究的需求不断增加，UMNSAH/DF-1 细胞的使用也逐渐受到广泛认可。但是UMNSAH/DF-1 细胞在运输过程中容易受到外界温度波动的影响，在温度变化的条件下或外界温度较低时，UMNSAH/DF-1 细胞可能会出现大量“空泡化”现象，即细胞内形成较多空泡，这可能与温度对细胞膜的渗透性和细胞器的功能有关，通常被视为细胞发生异常或受到一些刺激时的一种响应[5-6]。

温度对于细胞培养来说是一个关键的环境因素，会直接影响到细胞的生长、代谢和功能。而细胞培养的最佳温度则是由多个因素综合影响来决定。不同种类、不同来源的细胞对于生长的最适温度有所不同。但一般而言，禽类动物细胞在培养过程中常在温度为39 ℃左右的条件下表现出较好的生长特性，UMNSAH/DF-1 细胞可能也不例外。本文旨在通过系统性的实验研究，比较不同温度下培养对UMNSAH/DF-1 细胞生长及“空泡化”程度的影响，同时通过模拟活细胞株常温运输环境来探究改善UMNSAH/DF-1 细胞生长状态及减少其胞体“空泡化“现象的方法，以期为未来疫苗研发、抗病毒治疗和基础研究提供更为可靠的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1 来自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（目录号：GNO30）；DMEM 培养基、胎牛血清FBS、胰酶、双抗购于赛默飞世尔科技公司；PBS、DMSO 购于国药控股股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞传代及显微拍照

当UMNSAH/DF-1 细胞融合率达到80%以上时进行1：2 传代处理。弃去旧培养基，加1～2 ml 的0.25%胰酶于培养瓶中，置于39 ℃培养箱中消化2～3 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加3～6 mL 完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出至离心管，离心（1 000 rpm，5 min）。弃去上清液，加1～3 mL 完全培养基重悬。将重悬后细胞悬液转移至两个新的T25 培养瓶中，补充新的完全培养基至8～10 mL/瓶，将两瓶摇匀后UMNSAH/DF-1 细胞分别置于37℃、39 ℃二氧化碳培养箱中观察培养。当细胞培养至第24 h、48 h、72 h、4 天时镜下观察细胞形态并显微拍照。

1.2.2 细胞换液

提前将DMEM 完全培养液（含10% FBS）、PBS 置于37 ℃水浴锅中进行预热。从二氧化碳培养箱中取出培养瓶，显微镜下观察细胞状态。吸出旧培养基，加入2～3 mL D-PBS 缓慢清洗细胞2 遍以去除残余培养基。加入5～8 mL 事先预热好的DMEM 完全培养液，分别将细胞移至37 ℃与39 ℃二氧化碳培养箱中继续观察培养。

1.2.3 模拟活细胞株常温运输环境

将生长状态良好且处于对数生长期的UMNSAH/DF-1 细胞灌满新鲜的DMEM 完全培养液（含10%FBS）至T25 培养瓶颈部（保留微量空气），拧紧瓶盖且通过封口膜密封瓶口。将细胞置于室温中（10 ℃～25 ℃）分别放置0 天、1 天、2 天、4 天后显微镜下观察细胞形态并拍照。将室温放置4 天且胞体出现大量“空泡”的UMNSAH/DF-1 细胞进行1：2 传代处理，之后将传代后的细胞移至39 ℃二氧化碳培养箱中静置培养。当细胞培养至第24 h、48 h 时显微镜下观察细胞形态并拍照。

2 结果与讨论

2.1 不同温度下培养对UMNSAH/DF-1 细胞生长及“空泡化”的影响

为了比较不同的培养温度对UMNSAH/DF-1 细胞生长状态及“空泡化”现象的影响，我们将等量传代的2瓶UMNSAH/DF-1 细胞（T25 培养瓶）分别置于37 ℃与39 ℃恒温二氧化碳培养箱中观察培养。结果发现温度对UMNSAH/DF-1 细胞株的生理状态和胞体“空泡”的数量具有显著影响。相较于37 ℃，39 ℃的培养温度更适合UMNSAH/DF-1 细胞的生长，同时也可显著减少UMNSAH/DF-1 细胞胞体“空泡”的产生（如图1 显示），细胞状态较好。

图1 比较37 ℃与39 ℃培养时UMNSAH/DF-1 细胞的生长状态及“空泡化”程度

2.2 探究常温运输对UMNSAH/DF-1 细胞生长及“空泡化”的影响

通过模拟活细胞株常温运输环境(温度曲线如图2所示)，分别将灌满与未灌满新鲜完全培养液的UMNSAH/DF-1 细胞置于室温环境中（10 ℃～25 ℃）分别放置0 天、1 天、2 天、4 天后观察UMNSAH/DF-1 细胞生长状态及“空泡化”程度。结果显示：当灌满完全培养液的UMNSAH/DF-1 细胞常温放置1～2 天时，开始出现部分未完全贴壁且透亮的圆细胞（属正常现象），同时贴壁的UMNSAH/DF-1 细胞胞体也开始出现少量“空泡”化现象（如图3b，3c 显示）。常温放置至第4 天时，UMNSAH/DF-1 胞体“空泡化”现象显著增加（如图3d 显示）。而未灌满完全培养液的UMNSAH/DF-1 细胞从第2 天开始细胞增殖显著减少，细胞状态相较于灌满培养液组较差（如图3f-3h 显示）。

图2 模拟活细胞株常温运输的环境实时温度曲线（天）

图3 探究常温放置0 天、1 天、2 天、4 天时灌满完全培养液（图3a-3d）与未灌满完全培养液（图3e-3h）对MNSAH/DF-1 细胞生长状态及“空泡化”程度的影响

2.3 探究传代培养对UMNSAH/DF-1 细胞生长及“空泡化”的影响

当发现室温放置4 天后的UMNSAH/DF-1 细胞胞体开始出现大量的“空泡”时，我们尝试将该细胞进行正常传代后置于39 ℃二氧化碳培养箱中继续观察培养，结果发现：UMNSAH/DF-1 细胞内的“空泡”数量又会显著减少，且随着细胞传代次数的增加UMNSAH/DF-1 细胞生长状态也逐渐恢复正常，不影响后续实验的扩增培养（如图4 显示）。由此可见：将UMNSAH/DF-1 细胞置于室温放置时间越长，胞体“空泡化”现象越显著，严重时可直接影响细胞后续的生长状态，而传代培养对UMNSAH/DF-1 细胞出现大量“空泡化”现象后具有明显的改善效果。

图4 探究传代培养对MNSAH/DF-1 细胞生长状态及“空泡化”程度的影响

3 结论

从实验结果来看，生长温度下对UMNSAH/DF-1 细胞的生长状态及“空泡化”程度的影响非常显著。相较于37 ℃，39 ℃的培养温度更有利于UMNSAH/DF-1 细胞的生长，同时也可显著减少UMNSAH/DF-1 细胞胞体“空泡化”现象的发生。而通过常温运输UMNSAH/DF-1活细胞时，UMNSAH/DF-1 细胞在室温环境中放置的时间越久，其胞体“空泡化”现象就会越明显，且灌满完全培养液后进行运输的活细胞株状态相较于未灌满培养液组来说细胞生长状态会更好。但是将产生大量“空泡”的UMNSAH/DF-1 细胞进行正常传代培养后，其胞体“空泡”的数量又会显著减少，且随着细胞传代次数的增加，UMNSAH/DF-1 细胞又会逐渐恢复至其正常的生长状态。总之，我们的实验结果表明：相较于37 ℃，39 ℃的生长温度与传代培养可显著改善UMNSAH/DF-1 细胞生长状态及“空泡化”程度。UMNSAH/DF-1 细胞在常温运输过程中也更容易受到温度波动的影响，温度过低时细胞胞体会产生大量的空泡。但是将收到的UMNSAH/DF-1 细胞进行正常传代处理后细胞就会逐渐恢复至其正常状态。