甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变与民族及临床病理特征的关系

刘超宇,黄林达,马燕飞,潘秀虹,朱晓莹△

1.右江民族医学院附属医院临床病理诊断与研究中心,广西百色533000;2.广西肝胆疾病分子病理学重点实验室,广西百色533000;3.广西高校肿瘤分子病理学重点实验室,广西百色 533000;4.右江民族医学院附属医院腺体外科,广西百色 533000;5.右江民族医学院附属医院血液内科,广西百色533000

甲状腺癌是临床上发病率最高的一种内分泌恶性肿瘤,占全球每年所有诊断癌症总数的3%[1]。大多数甲状腺肿瘤是由滤泡细胞衍生的甲状腺恶性肿瘤,可分为滤泡性甲状腺癌(6%～10%)、甲状腺乳头状癌(65%～93%)、未分化甲状腺癌(0.3%～6.7%)[2]。虽然,大部分甲状腺癌恶性程度低,预后较好,但仍有小部分甲状腺癌患者早期就出现淋巴结转移。因此,如何对甲状腺结节的良恶性做出精准的判断就显得尤为重要[3]。近年来,随着精准医学的飞速发展,肿瘤分子病理学诊断技术日渐成熟,甲状腺癌的病理诊断也不再仅限于镜下判读。研究表明,鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因是甲状腺癌中最常见的驱动突变基因,其中翻转突变导致缬氨酸在600号氨基酸位置(V600E)被谷氨酸取代,与甲状腺癌的发生、发展密切相关[4]。BRAF V600E基因突变是BRAF最常见的突变类型,这一突变可改变其下游编码产物,激活MAPK信号通路,进而诱导肿瘤细胞的过度增殖及分化[5]。BRAF V600E基因突变在甲状腺癌的不同病理类型中突变率不同,且BRAF V600E基因突变与甲状腺癌的高侵袭性、高复发性及不良的临床预后明显相关,进而影响肿瘤细胞的包膜外浸润、淋巴结转移、肿瘤多灶性及治疗的有效性[5]。现有研究表明,在我国不同地区及民族人群中,BRAF V600E基因突变率存在明显差异,且BRAF V600E基因突变与临床病理特征的关系也有所不同[6]。因此,本研究以壮族人口聚集地广西壮族自治区百色市壮族与汉族甲状腺癌患者300例为研究对象,对壮族与汉族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况及其临床病理特征进行对比分析,以期为甲状腺癌个体化诊疗提供新的临床依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选取2021年1月至2023年1月于右江民族医学院附属医院确诊的甲状腺癌患者300例作为研究对象,收集其病理标本,其中男150例、女150例,平均年龄(40.2±11.26)岁,肿瘤分型：乳头状癌264例(88.00%)、滤泡状癌15例(5.00%)、未分化癌21例(7.00%),≥40岁150例、<40岁150例,肿瘤最大径：<2 cm 136例、2～4 cm 164例,淋巴结数目：0个99例、1～4个109例、>4个92例。根据患者民族将研究对象分为壮族150例和汉族150例。壮族病例中男75例,女75例;≥40岁78例,<40岁72例;肿瘤分型：乳头状癌134例,滤泡状癌8例,未分化癌8例;肿瘤最大径：<2 cm 66例,2～4 cm 84例;淋巴结数目：0个45例,1～4个61例,>4个44例。汉族病例中男75例,女75例;≥40岁72例,<40岁78例;肿瘤分型：乳头状癌130例,滤泡状癌7例,未分化癌13例;肿瘤最大径：<2 cm 70例,2～4 cm 80例;淋巴结数目：0个54例,1～4个48例,>4个48例。两组甲状腺癌患者的性别、年龄、肿瘤分型、肿瘤最大径、淋巴结数目比较,差异均无统计学意义(P<0.05)。纳入标准：(1)均为广西百色籍常住人口;(2)术后行常规病理学检查,由2名病理专家阅片,并明确肿瘤大小、淋巴结数目及病理分型。排除标准：(1)合并有其他恶性肿瘤的患者;(2)合并有严重肾、肺、肝等疾病的患者[7]。所有研究对象均知晓本研究,并签署知情同意书。本研究经右江民族医学院附属医院医学伦理委员会审批通过(批号：2023061601)。

1.2试剂与仪器 石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司,批号：2023021001);BRAF V600E基因突变检测试剂盒(北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司,批号：2022120802);ABI 7500 fast实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪(美国ABI公司);超微量分光光度计(美国ThermoScientific公司)。

1.3方法

1.3.1全基因组DNA提取 所有患者的手术标本在离体后30 min内经10%福尔马林溶液充分固定、脱水、石蜡包埋、连续切片(4 μm)后行苏木精-伊红(HE)染色。染色后经2名高年资病理医师阅片明确该标本中肿瘤细胞占比,选取肿瘤细胞占比超20%的石蜡组织标本,连续切片8～10张(5 μm)制备蜡卷,蜡卷置于无酶EP管中,按照DNA提取试剂盒说明书进行全基因组DNA提取。提取出的DNA经超微量分光光度计检测,以浓度>5 ng/μL,A260/280在1.8～2.0为符合要求的NDA样本,可以进行基因检测。

1.3.2BRAF V600E位点的基因突变检测 采用qRT-PCR对提取出的全基因组DNA进行BRAF基因V600E位点突变检测,检测流程中的全部操作均在标准的PCR实验室中进行,每次检测时同时设置阴性对照、阳性对照及外控基因。若待测样本中BRAF基因V600E位点出现明显的S型扩增曲线,记录Ct值,将BRAF基因V600E位点Ct值与外控基因Ct值相减,计算出ΔCt值,当ΔCt值≤8时,结果判读为阳性。

2 结 果

2.1壮族、汉族病例甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况比较 BRAF基因V600E位点的基因突变结果发现,300例甲状腺癌患者中突变型221例,野生型79例。壮族病例中突变型108例(72.00%),野生型42例(28.00%);汉族病例中突变型113例(75.33%),野生型37例(24.67%),不同民族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 壮族、汉族病例BRAF V600E基因突变情况比较[n(%)]

2.2不同年龄、肿瘤最大径和淋巴结数量甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率比较 <40岁的甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为88.67%,明显高于≥40岁患者的58.67%,差异有统计学意义(P<0.05);但不同肿瘤最大径及不同淋巴结数目甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同临床年龄、肿瘤最大径和淋巴结数目甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况比较[n(%)]

2.3不同性别、不同民族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况比较 壮族男性甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为86.67%、女性为57.33%,汉族男性甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为54.67%、女性为96.00。相同民族不同性别甲状腺癌患者间BRAF V600E基因突变率比较,差异均有统计学意义(P<0.01);相同性别不同民族甲状腺癌患者间BRAF V600E基因突变率比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 不同民族、不同性别之间BRAF V600E基因突变情况比较[n(%)]

2.4不同年龄、不同民族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况比较 ≥40岁壮族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为53.85%,<40岁为91.67%;≥40岁汉族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为63.89%,<40岁为85.90%。同一年龄范围内不同民族间BRAF V600E基因突变率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 不同年龄、不同民族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况比较[n(%)]

2.5不同肿瘤最大径、不同民族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况比较 肿瘤最大径<2 cm的壮族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为60.61%,肿瘤最大径2～4 cm的为80.95%;肿瘤最大径<2 cm的汉族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为92.86%,肿瘤最大径2～4 cm的为60.00%。肿瘤最大径<2 cm的不同民族甲状腺癌患者间BRAF V600E基因突变率比较,差异有统计学意义(P=0.001),肿瘤最大径为2～4 cm的不同民族甲状腺患者间BRAF V600E基因突变率比较,差异有统计学意义(P=0.003),见表5。

表5 不同肿瘤最大径、不同民族甲状腺癌患者BRAFV600E基因突变情况比较[n(%)]

2.6不同淋巴结数目、不同民族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况比较 0个淋巴结的壮族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为73.33%,1～4个为72.13%,>4个为70.46%;0个淋巴结汉族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率为74.07%,1～4个为75.00%,>4个为77.08%。相同淋巴结数目的不同民族甲状腺患者间BRAF V600E基因突变率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表6。

表6 不同淋巴结数目、不同民族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变情况比较[n(%)]

2.7不同民族、不同甲状腺癌分型患者BRAF V600E基因突变情况比较 不同民族甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌及甲状腺未分化癌患者BRAF V600E基因突变率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 不同民族、不同甲状腺癌分型患者BRAF V600E基因突变情况比较[n(%)]

3 讨 论

甲状腺癌是临床上常见的一种恶性肿瘤,且近年来发病率呈逐年上升趋势[8]。2002年报道首次在人类癌症中检测到BRAF基因突变,此后,陆续鉴定出40多种BRAF基因突变[9-10]。大多数激活BRAF基因突变的病例涉及密码子600并导致V600E突变[11]。另有研究表明,甲状腺癌BRAF V600E基因突变与遗传因素明显相关,其在不同国家、地区及人群中的突变情况各有不同[12-14]。

BRAF是编码丝氨酸的特异性蛋白激酶,该激酶是影响细胞增殖、分化和成熟细胞功能的细胞信号通路的关键换能器。BRAF基因经常在许多不同的癌症类型中发生突变,包括甲状腺癌、黑色素瘤、结直肠腺癌、胶质母细胞瘤等,在发生BRAF基因突变的癌症中观察到的激活点突变或小的帧内缺失通常发生在编码蛋白激酶结构域的序列中[15-18]。最常见的是BRAF突变(T1799A)编码的BRAF V600E突变,其中活化环内氨基酸600处的缬氨酸被谷氨酸取代,可使BRAF激酶活性持续活跃,活性增加高达500倍[19-21]。突变激活的 BRAF V600E可进一步驱动下游 MEK1/2→ERK1/2 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活,为癌细胞中BRAF→MEK→ERK通路的组成性激活提供了促进细胞分裂周期的信号[22-24]。在既往文献中报道了不同国家、人种甲状腺癌患者BRAF V600E突变情况,如希腊的甲状腺乳头状癌患者BRAF V600E突变率为17%[12]。我国西北地区甲状腺癌患者BRAF V600E突变率为86.7%[13-14]。本研究结果显示,相同民族不同性别甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率比较,差异均有统计学意义(P<0.01);壮族病例组和汉族病例组相同性别甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。上述结果提示,百色市甲状腺癌患者BRAF V600E的基因突变率存在性别差异。

本研究结果还发现,不同年龄患者BRAF V600E基因突变率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。ZHANG等[25]在一项25 241 例甲状腺乳头状癌患者的Meta分析中表明BRAF基因V600E突变与年龄无关;SHEN等[26]进行的一项多中心研究显示,甲状腺乳头状癌患者BRAF V600E基因突变与年龄相关,且患者病死率与年龄的增长呈正相关。尽管本研究结果显示BRAF V600E基因突变与年龄相关,但有可能是因样本量小所致,仍需进一步研究。

本研究结果还发现,肿瘤最大径<2 cm的汉族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率明显高于壮族,差异有统计学意义(P<0.05);肿瘤最大径为2～4 cm的壮族甲状腺癌患者BRAF V600E基因突变率明显高于汉族,差异有统计学意义(P<0.05)。但在3种不同病理分型甲状腺癌患者中,壮族与汉族甲状腺癌患者BRAF V600E突变率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。提示病理分型并非甲状腺癌BRAF V600E基因突变的相关因素。但肿瘤最大径可能是影响甲状腺乳头状癌患者BRAF V600E基因突变率的因素之一,且该因素可能具有民族差异性。上述结果对了解BRAF V600E基因突变在壮族与汉族甲状腺癌患者中的分布情况,以及对甲状腺癌患者的协助诊治和预后评估可能具有重要的临床意义。

综上所述,百色市甲状腺癌患者BRAF V600E位点的基因突变率与民族及肿瘤病理分型无关,与年龄、性别及肿瘤最大径有关,其中年龄在不同民族间无差异,性别在相同及不同民族间均有差异,但肿瘤最大径只在不同民族间存在差异。本研究BRAF V600E位点基因突变的检测结果为日后深入开展甲状腺癌的个体化诊疗提供了新的临床参考依据。