PKM2对黑色素瘤细胞侵袭与迁移及巨噬细胞M2转变的影响

任晓朦,刘清霞,赵培庆

1.滨州医学院第一临床医学院,山东烟台 264003;2.山东省淄博市中心血站中心实验室,山东淄博 255033;3.山东省淄博市张店区房镇镇卫生院妇幼保健科,山东淄博 255030;4.山东省淄博市中心医院转化医学中心,山东淄博 255036

黑色素瘤特别是晚期患者病死率极高,目前仍是世界范围内最难治的恶性肿瘤之一[1]。乳酸是糖酵解过程中的主要代谢产物,有研究表明黑色素瘤细胞可通过摄取乳酸来抵御氧化应激压力,从而获得更强的转移能力[2]。丙酮酸激酶M2(PKM2)作为糖酵解途径最主要限速酶之一,通过影响肿瘤微环境在多种类型肿瘤中促进疾病进展[3]。然而,PKM2在黑色素瘤患者转移及预后中的相关研究尚不清楚。基于以上理论基础,本研究旨在探索PKM2影响黑色素瘤转移的潜在机制,进一步阐明PKM2如何影响肿瘤微环境(TME)中巨噬细胞M1/M2转变过程。现报道如下。

1 材料与方法

1.1基于TCGA数据库分析黑色素瘤中PKM2表达水平及与生存期的关系 利用来源于TCGA数据库[GEPIA 2 (cancer-pku.cn)]的461例黑色素瘤患者及558例健康研究对象分析PKM2在黑色素瘤组织及正常组织中的表达差异、PKM2与生存期相关性及PKM2在不同临床分期黑色素瘤中的表达情况。其中80例有随访生存期数据的黑色素瘤患者用于比较PKM2基因高表达组(20例)与PKM2基因低/中表达组(60例)的总体生存时间;79例有临床分期数据的黑色素瘤患者用于比较PKM2基因在不同临床分期患者中的表达差异,其中临床分期包括2期39例,3期36例,4期4例。

1.2细胞来源、细胞培养与载体构建 人A375黑色素瘤细胞系和小鼠RAW264.7巨噬细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所,置于37℃、5% CO2环境下含10%胎牛血清 (FBS,Gibco) 的改良Eagle’s培养基 (DMEM、Gibco) 进行培养。课题组利用基因敲低技术对PKM2表达水平进行敲低并验证敲低效率,PKM2过表达(过表达组,n=3)及基因敲低慢病毒载体(敲低组,n=3)及其对照慢病毒载体(对照组)均由上海GeneChem公司构建,病毒加入量按照公司提供的感染复数值进行转染。

1.3黑色素瘤细胞胞外酸化率(ECAR)及乳酸水平检测 ECAR采用美国Agilent公司的SeaHorse XF细胞外通量分析仪进行测定。分析前需在特定的时间点处理细胞：葡萄糖 (10 mmol/L),然后是寡霉素 (1 μmol/L)和2-DG (50 mmol/L)。最后用SeaHorse XF软件测量ECAR值。其中加入葡萄糖之前测定的ECAR值为“基础期”,加入葡萄糖之后与加寡霉素之前测定的ECAR值为“糖酵解能力”,加入寡霉素之后与加2-DG之前测定的ECAR值为“糖酵解容量”,加入2-DG之后测定的ECAR值为“恢复期”。采用乳酸测定试剂盒(南京建成科技有限公司,A019-2-1)检测干扰PKM2后细胞乳酸产量。

1.4定量聚合酶链反应(qPCR) qPCR检测巨噬细胞M1/M2相关指标水平,其中代表M1极化的指标包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶 (iNOS),代表M2极化的指标包括甘露糖受体 (CD206)、血红蛋白清道夫受体 (CD163)。操作按厂家说明书,用Prime Scrip RT试剂盒 (Takara) 提取总信使RNA(mRNAs),合成互补DNA (cDNA)。qPCR反应在ABI PRISM7500仪器 (ThermoFisher Scientific) 上进行测量,qPCR采用的Real SYBR Mix 由青岛擎科生物科技股份有限公司生产。qPCR所用引物序列见表1,反应条件如下：94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s,40个循环,最后72 ℃延伸2 min。

表1 引物序列表

1.5蛋白免疫印迹法 首先用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白产物,并将其转移到PVDF膜 (Bio-Rad) 上。然后用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h,并在4 ℃下与PKM2一抗 (abcam,ab85555) 孵育过夜;洗膜3次后于室温下与二抗共同孵育2 h,最后使用Tanon 5200凝胶成像仪进行显影,对敲低PKM2后的表达量进行检测。

1.6免疫组化染色 黑色素瘤组织收集淄博市中心医院2010年5月至今经病理诊断确诊为黑色素瘤患者,排除患者患有其他类型肿瘤、代谢性疾病、炎症性疾病等可能影响结果的疾病,共计20例,其中转移组7例(已发生淋巴结转移或远端转移的黑色素瘤患者),非转移组13例(未发生淋巴结转移的黑色素瘤患者)。转移组男4例、女3例,平均年龄(64.71±12.26)岁,非转移组男7例、女6例,平均(59.62±11.80)岁。两组性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果采用半定量评分标准对标本组织中的PKM2表达量进行分析,染色指数值(0～12)定义为染色强度与阳性区域得分的乘积。对染色强度评分如下：0分=无染色;1分=弱染色;2分=中等染色;3分=强染色。阳性区域定义如下：<5%染色=0分;5%～25%染色=1分;>25%～50%染色=2分;>50%～75%染色=3分;>75%染色=4分[4]。所有研究对象均自愿参与本研究,并签署知情同意书,本研究经淄博市中心医院医学伦理委员会审核通过(批号：2020-1-045)。

1.7流式细胞术 CD206流式荧光抗体购自BD公司,抗体与细胞室温孵育30 min后,用PBS洗涤3次,然后用BD FACS流式细胞仪 (Aria Ⅱ,USA) 对CD206的表达水平进行分析。

1.8细胞划痕实验及Transwell实验 敲低黑色素瘤细胞中PKM2表达后,进行肿瘤细胞迁移实验。黑色素瘤细胞系A375种板于六孔板中,分为对照组、PKM2敲低组、PKM2敲低+乳酸组,待细胞贴壁后用200 μL枪头于孔中间划痕,然后细胞进行换液以去除漂浮细胞,显微镜下拍照并测量原始划痕宽度;24 h后置于显微镜下测量划痕愈合宽度,与原始划痕宽度比较,得到愈合比例。黑色素瘤细胞系A375接种于Transwell小室中,分为对照组、PKM2敲低组、PKM2敲低+乳酸组,血清浓度为1%,下室血清浓度为10%,形成浓度梯度;24 h后取出Transwell小室,用棉棒小心擦去小室内残留细胞,小室经过固定、结晶紫染色、冲洗后,置于显微镜下拍照并计数。

2 结 果

2.1PKM2在黑色素瘤组织中表达情况 TCGA数据库显示,与正常组织(8.66±1.19)相比,PKM2 mRNA水平在黑色素瘤组织中(10.97±1.78)明显升高(P<0.05),且PKM2高表达水平患者的生存率低于低/中表达患者(P=0.001 8),见图1A、1B;PKM2在临床2期黑色素瘤患者中的表达水平为4.63±1.78,在3期黑色素瘤患者中的表达水平为6.25±1.55,在4期黑色素瘤患者中的表达水平为8.71±0.13,不同临床分期黑色素瘤患者的PKM2表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),见图1C。免疫组化染色结果发现,转移组PKM2表达评分为(8.00±2.52)分,明显高于非转移组的(4.54±1.32)分,差异有统计学意义(P<0.05),见图1D、1E。

注：*P<0.05;A为TCGA数据库中PKM2在黑色素瘤组织中的表达;B为TCGA数据库中不同PKM2表达患者生存曲线;C为TCGA数据库中PKM2在不同临床分期黑色素瘤晚期患者中的表达;D为PKM2在未发生转移的黑色素瘤患者中的免疫组化染色情况(×200);E为PKM2在发生转移的黑色素瘤患者中的免疫组化染色情况(×200)。

2.2敲低PKM2后黑色素瘤细胞糖酵解水平变化 敲低PKM2表达水平后,PKM2 mRNA水平下降了61%(对照组相对表达量为1.0,PKM2敲低组相对表达量为0.39),蛋白水平也明显下调,见图2;敲低组黑色素瘤细胞糖酵解能力和糖酵解容量均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。另外,PKM2敲低组乳酸水平[(4.93±0.87) mmol/L]明显低于对照组[(12.33±1.55) mmol/L],差异有统计学意义(t=40.99,P<0.001)。

图2 敲低PKM2后蛋白表达水平变化

表2 敲低PKM2后黑色素瘤细胞糖酵解水平的变化

2.3敲低PKM2后黑色素瘤细胞侵袭与迁移能力的变化 细胞划痕实验显示,对照组愈合率为25%,PKM2敲低组为75%,PKM2敲低组加入乳酸后为50%;Transwell实验结果显示,对照组穿过细胞数为(58±7.21)个/LP(低倍视野),PKM2敲低组细胞数为(26±3.21)个/LP,PKM2敲低组加入乳酸后细胞数为(50±4.58)个/LP。细胞迁移实验结果显示,敲低PKM2表达后,黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力均明显降低,加入乳酸后,可部分逆转该现象,见图3。

注：A为敲低PKM2后黑色素瘤细胞迁移能力的变化;B为敲低PKM2后黑色素瘤细胞侵袭能力的变化。

2.4qPCR检测巨噬细胞M1/M2相关指标水平情况 qPCR检测结果显示,过表达组TNF-α和iNOS水平低于对照组,而CD206和CD163水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3;敲低组TNF-α和iNOS水平高于对照组,而CD206和CD163水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表4。流式细胞实验结果显示,敲低PKM2后巨噬细胞M2标志物CD206表达受到抑制,对照组平均荧光强度(MFI)为32.5±4.27,敲低组MFI值24.6±2.17;过表达PKM2后则M2标志物CD206表达明显增多,对照组MFI值为23.6±1.64,过表达组MFI值为48.9±3.05。

表3 过表达组与对照组巨噬细胞M1/M2相关指标水平比较

表4 敲低组和对照组巨噬细胞M1/M2相关指标水平比较

3 讨 论

糖酵解是肿瘤生长和转移的主要能量来源[5]。肿瘤代谢从线粒体氧化磷酸化到有氧糖酵解的转变被称为瓦氏效应,由于有氧糖酵解导致的肿瘤进展通常与癌基因的激活或肿瘤抑制基因的丧失有关。因此,抑制糖酵解是肿瘤治疗的重要策略之一[6]。PKM2是一种糖酵解限速酶,有报道称其在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌和肝癌中过表达并促进肿瘤进展[7-9]。然而PKM2在黑色素瘤中的表达情况及相关生物学机制尚不清楚。笔者利用TCGA数据库发现,与正常组织相比,PKM2 mRNA水平在黑色素瘤组织中表达明显升高(P<0.05),且PKM2高表达水平患者的生存率低于低/中表达患者(P=0.001 8);对黑色素瘤患者分组后分析发现,PKM2在临床中晚期黑色素瘤患者中的表达水高于早期患者,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化染色结果发现,转移组PKM2表达评分为(8.00±2.52)分,明显高于非转移组的(4.54±3.55)分(P<0.05)。以上结果表达PKM2可能在黑色素瘤转移中发挥重要的促进作用。

2022年,HANAHAN[10]的一项研究指出肿瘤的十二大特征,其中能量代谢重编程是肿瘤细胞主要特征之一,表明近年来肿瘤代谢正在成为肿瘤诊疗的重要靶点[11]。肿瘤细胞必须改变其能量代谢途径,从而实现持续的细胞增殖能力、存活率,以及致命的远端转移能力。代谢重编程包括肿瘤细胞增加对葡萄糖的吸收率,这是提供给肿瘤细胞所需能量的主要途径,这些大分子物质包括脂质、碳水化合物、氨基酸和核酸[12]。不过即使在充足的氧气环境中糖酵解也被认为是肿瘤细胞利用能量的主要方式,因此近年来糖酵解增强也被认为是癌症细胞的重要特征,它通过影响细胞代谢正向调控肿瘤的发生与发展[13]。与正常细胞不同,肿瘤细胞优先倾向于将葡萄糖转化为丙酮酸盐,然后通过乳酸脱氢酶(LDH)将其代谢为乳酸。然而,在常氧条件下,丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶(PDH)转化为乙酰辅酶A。最初的研究认为线粒体功能障碍导致氧化磷酸化途径由有氧糖酵解替代,但进一步的研究表明肿瘤细胞的线粒体功能和氧化磷酸化(OXPHOS)途径与正常细胞不同,肿瘤细胞维持高水平的乙二醇分解率和氧化磷酸化能力以满足肿瘤细胞的高能量需求。在肿瘤细胞中,糖酵解逐渐增加,而OXPHOS逐渐减少,随着糖酵解的增加,乳酸在肿瘤细胞周围增多,从而形成特定的肿瘤酸性微环境。乳酸,作为一种代谢调节因子,通过增加酸度和血管生成、减少血管通透性和改变免疫反应来促进癌症转移[14]。基于上述理论以及PKM2在黑色素瘤中高表达现象,笔者检测了敲低PKM2后黑色素瘤细胞糖酵解相关指标,敲低PKM2表达水平后,PKM2 mRNA水平下降了61%(对照组相对表达量为1.0,PKM2敲低组相对表达量为0.39),蛋白水平也明显下调,且敲低组黑色素瘤细胞糖酵解能力和糖酵解容量均低于对照组(P<0.05),另外,敲低组乳酸水平明显低于对照组,差异有统计学意义(t=40.99,P<0.001),与相关研究结果一致。上述结果提示PKM2促进了黑色素瘤中乳酸的分泌水平。有研究发现乳酸可促进黑色素瘤细胞侵袭与迁移能力[15],因此本研究敲低黑色素瘤细胞中PKM2表达后,进行肿瘤细胞迁移实验,结果发现敲低PKM2表达后,黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力均明显降低,加入乳酸后,可部分逆转该现象,提示PKM2以乳酸依赖方式促进黑色素瘤细胞侵袭与迁移能力。

LIN等[16]研究发现肿瘤微环境中乳酸水平可促进巨噬细胞M1/M2转变。TME涉及肿瘤基质、增殖的肿瘤细胞、炎症细胞,以及各种相关的组织细胞。肿瘤的发展是由癌症细胞和其他细胞之间的互相串扰,进而控制TME中的免疫细胞数量与活性。肿瘤的代谢特征之一是有氧糖酵解代谢产物乳酸的大量积聚。肿瘤细胞引起大量乳酸积聚,这是TME的显著特征。研究表明乳酸不仅是代谢重新编程的副产品,而且是一种关键的TME信号分子。TME中乳酸的含量与肿瘤转移和肿瘤免疫逃逸密切关联[17]。肿瘤由此导致免疫抑制,从而促进肿瘤的进展。因此,酸性TME微环境对肿瘤的影响已成为肿瘤研究热点。研究证实,在肿瘤组织中,乳酸盐通过PGC-1α介导的氧化磷酸化调控肿瘤增殖[18]。此外,乳酸通过调节肿瘤细胞生长、转移和维持乳腺癌特异性能量代谢的HCAR1途径促进肿瘤进展[19]。此外,CD147-K234是一种糖蛋白,通过提高乳酸产量,控制细胞代谢和促进非小细胞肺癌(NSCLC)进展[20]。有研究表明,乳酸参与子宫内膜癌TME形成,以及参与肿瘤生长和血管生成[21]。高乳酸水平与高子宫内膜癌复发率密切相关。然而乳酸在子宫内膜癌TME中的调节机制有待深入调查。本研究结果显示,巨噬细胞过表达组TNF-α和iNOS水平低于对照组,而CD206和CD163水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),且敲低组TNF-α和iNOS水平高于对照组,而CD206和CD163水低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。笔者进一步探究PKM2是否也参与了乳酸调控TME过程,首先把过表达或敲低PKM2的黑色素瘤细胞与巨噬细胞共培养,结果发现过表达组TNF-α和iNOS水平低于对照组,而CD206和CD163水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),提示PKM2可显著促进巨噬细胞M2转变;敲低组TNF-α和iNOS水平高于对照组,而CD206和CD163水低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),提示敲低PKM2后巨噬细胞M2标志物CD206表达受到抑制;流式细胞实验结果显示,敲低PKM2后巨噬细胞M2标志物CD206表达受到抑制,对照组平均荧光强度(MFI)为32.5,敲低组MFI值24.6;过表达PKM2后则M2标志物CD206表达明显增多,对照组MFI值为23.6,过表达组MFI值为48.9。以上结果提示PKM2介导了巨噬细胞M1/M2转变进程,可能通过影响TME促进了黑色素瘤进展。

总之,本研究发现PKM2在黑色素瘤发生转移组中表达上调,在黑色素瘤转移中发挥重要的促进作用。进一步研究发现PKM2以乳酸依赖方式促进黑色素瘤细胞侵袭与迁移。更重要的是,PKM2介导了巨噬细胞M1/M2转变进程,是重塑黑色素瘤TME重要参与分子之一。然而,本研究涉及的分子机制尚不深入,PKM2通过何种机制导致黑色素瘤侵袭与迁移能力的增加,以及如何调控巨噬细胞M1/M2转变的深层分子机制等问题,均需要进行更深入的研究与探讨。