小麦B 淀粉一步酶解产糖优化及酒精发酵

2024-05-12张晶晶陈家新冯军伟胡景婷马欣荣解心月

食品工业科技 2024年10期

张晶晶，陈家新，冯军伟，胡景婷，马欣荣，张楠，解心月，刘娜，王心,4,5,6，惠明,5,6,*

（1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450000；2.河南工业大学小麦和玉米深加工国家工程研究中心，河南郑州 450001；3.河南飞天农业开发股份有限公司，河南鹤壁 456750；4.许昌学院食品与药学院，河南许昌 461000；5.工业微生物菌种保藏与选育河南省工程实验室，河南郑州 450001；6.小麦生物加工与营养功能河南省重点实验室，河南郑州 450001）

小麦淀粉是对小麦面粉进一步深度加工的产物，工业化生产的小麦淀粉一般分有A、B 两种类型，A 淀粉粒径为10～35 μm，颗粒较大呈透镜型，B 淀粉粒径为2～5 μm，颗粒较小呈圆形[1-2]。A 淀粉是精制淀粉，基本不含杂质或含量极少，广泛应用于食品、化工、医药等方面。B 淀粉作为生产A 淀粉的副产物，其含量占原料小麦面粉总量的10%～20%[3]。小麦B 淀粉除含有大量淀粉外，还有蛋白质、戊聚糖[4-6]等杂质，由于特殊的理化性质无法像A 淀粉那样用于商品淀粉制作。国内外研究者均对提高小麦B 淀粉利用价值进行了一些探索，研究表明，利用小麦B 淀粉生产高麦芽糖浆[7-8]，B 淀粉中由于含有戊聚糖和粗脂肪等成分，使得高麦芽糖浆过滤脱色困难[2]，从而影响了产品质量；莲花味精集团将小麦B 淀粉与A 淀粉混合制糖，用作发酵生产味精的原料，B 淀粉因存在一定量的非淀粉多糖，使得制糖过程中糖液黏度过高，从而影响发酵工艺[9]。也有将小麦B 淀粉浆用作饲料添加组分，但B 淀粉浆容易滋生大量微生物，其中霉菌会导致动物中毒，降低饲料营养价值[10]；此外，B 淀粉含有木聚糖等糖类，动物难以利用，影响其对食物吸收率，继而阻碍动物健康生长[9]。因此，优化B 淀粉的利用方式，解决其中的问题，对于提升小麦B 淀粉的利用价值具有重要意义。

酒精（乙醇）常用于医药、化工等领域，目前发酵酒精所用的原料主要糖蜜、淀粉、玉米和木质纤维素等。我国酒精发酵生产主要原料为玉米，玉米作为饲料最主要的原料，同时在保证肉类、奶制品等食品供应方面发挥重要作用，因此用玉米原料生产酒精存在“与人争粮”问题，原料多元化发展势在必行[11-12]。小麦B 淀粉价格低廉，以B 淀粉为原料发酵生产酒精，可以降低粮耗、节约资源，减少环境污染，提高经济效益。张军合等[13]与杜丽娜[14]采用传统发酵工艺生产酒精，即先利用α-淀粉酶将小麦B 淀粉进行高温蒸煮液化，然后利用糖化酶进一步水解成可发酵的糖，该法淀粉转化效率低耗时长，所需设备多[15]。研究表明，α-淀粉酶和糖化酶协同作用于淀粉可以提高水解效率，缩短酶解反应时间[16-18]。双酶法水解糖液纯度高，酶解反应条件温和、可控性好，因此利用双酶法酶解小麦B 淀粉制备可发酵糖可以有效的解决产量低、品质差的问题。

本研究以小麦B 淀粉为原料，在对其基本成分进行分析基础上，使用α-淀粉酶和糖化酶组成复合酶对B 淀粉进行一步酶解，为进一步提高酶解效率，详细考察复合酶用量、料液比、酶解温度、酶解时间及pH 对还原糖得率影响，并在此基础上利用正交优化确定最佳工艺参数。然后利用酿酒酵母菌株发酵上述酶解液生产酒精，为拓宽酒精生产原料，提高小麦B 淀粉利用价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦B 淀粉浆河南飞天农业有限公司；酿酒酵母菌株实验室保存；氢氧化钠、浓盐酸、无水乙醇天津市致远化学试剂有限公司；DNS 显色液福州飞净生物科技有限公司；地衣酚上海麦克林生化科技有限公司；α-淀粉酶（3700 U/g）、糖化酶（100000 U/g）北京奥博星生物技术有限责任公司；D-木糖、D-无水葡萄糖国药集团化学试剂有限公司；酵母粉、胰蛋白胨英国Oxoid 公司；YPD 培养基：10 g/L 酵母提取物、20 g/L 胰蛋白胨、20 g/L 葡萄糖，固体培养基加20 g/L 琼脂粉。

BSA124S 分析天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；DHG-9140A 电热恒温鼓风干燥箱、DHG-9140A 电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司；FE28 pH 计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T2600 紫外分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司；MS-H-S 磁力搅拌器大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；ZWF-110X30 恒温水浴振荡器上海智城分析仪器制造有限公司；JP-800C-6 多功能高速粉碎机永康市久品工贸有限公司；LC-2030 液相色谱仪日本岛津公司；BTP-3ES00X 台式冻干机美国Virtis 公司；Qunata 250FEG 扫描电子显微镜浙江纳德科学技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.2 小麦B 淀粉基本成分分析还原糖含量和淀粉含量测定参照3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法[20]，用DNS 法测得葡萄糖标准曲线方程y=1.6786x-0.0754，R2=0.9997；蛋白质含量采用GB 5009.5-2016凯氏定氮法[21]；灰分含量采用GB 5009.4-2016 中灰分含量的测定方法[22]；戊聚糖含量测定采用NY/T 2335-2013 谷物中戊聚糖含量测定方法中的分光光度法[23]（即地衣酚-盐酸法）进行戊聚糖含量的测定。

式中，m′为带入葡萄糖标准曲线得的含量，mg；V 为样品提取液总体积，mL；N 为稀释倍数；Vs 为测定时所取样品提取液体积，mL；m 为称取小麦B 淀粉的质量，g。

式中，G 为水解样中葡萄糖含量，mg；0.9 为淀粉与葡萄糖的转换系数；n 代表稀释倍数；m 为称取小麦B 淀粉的质量，g。

1.2.3 小麦B 淀粉酶解工艺流程首先称取一定量的α-淀粉酶和糖化酶溶解在水中，配制成α-淀粉酶含量为24 U/mL，糖化酶含量为150 U/mL 的复合酶溶液[24-25]备用。称取2.0000 g 小麦B 淀粉末，并加入50 mL 蒸馏水配制成淀粉浆。用0.5 mol/L 稀盐酸和氢氧化钠溶液调节pH 至5.0 左右，在沸水浴中加热15 min，使淀粉充分糊化。冷却到60 ℃左右，加入配制好的复合酶溶液，使其在恒温水浴振荡器中进行酶解反应。反应结束取1 mL 酶解液，沸水浴灭酶5 min，12000 r/min 离心2 min 后取上清液，测定葡萄糖当量（DE 值），计算公式如下：

式中：干物质含量为B 淀粉添加量。

1.2.4 单因素及优化工艺试验设计

1.2.4.1 单因素实验以DE 值为评价指标，在某一因素的研究中，其他因素设置为相应的固定值，即复合酶添加量为2 mL，料液比为1:20 g/mL，酶解温度为60 ℃，酶解时间为6 h，初始pH 为5，研究复合酶添加量（1、2、3、4、5 mL）、料液比（1:5、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）、酶解温度（50、55、60、65、70 ℃）、酶解时间（2、4、6、10、14、18、22、24 h）及pH（3、4、5、6、7）五个因素对DE 值的影响。

Countermeasures of constructing trade and logistics center of Xuzhou

1.2.4.2 正交试验优化在单因素实验的基础上，选取α-淀粉酶和糖化酶复合酶溶液添加量、料液比、酶解温度、酶解时间及pH 进行正交试验，每个因素安排3 个平行水平，以DE 值为评价指标，设计正交试验表（表1），研究利用酶法水解小麦B 淀粉的最佳工艺条件。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.2.5 B 淀粉酶解前后扫描电镜参照黄冬等[26]的方法并稍做修改。利用扫描电子显微镜（SEM）对B 淀粉及其糖化残渣的微观结构进行观察。将酶解后的残渣均匀的平铺在玻璃平板上，冷冻干燥24 h备用。剪取一段导电胶粘在铝制样品台上，用棉棒蘸取适量的样品，均匀涂抹在导电胶上，洗耳球吹去未粘紧的样品，喷金后置于电镜下依次用不同倍数放大扫描。

1.2.6 酿酒酵母发酵小麦B 淀粉生产酒精

1.2.6.1 小麦B 淀粉发酵液制备称取2.0000 g 小麦B 淀粉于250 mL 摇瓶中，并加入50 mL 蒸馏水将其溶解。用0.5 mol/L 氢氧化钠溶液和稀盐酸溶液调节pH 至5.0。然后在沸水浴中加热15 min，使淀粉充分糊化，冷却到60 ℃以下，加入4 mL 配制好的复合酶液并置于60 ℃恒温水浴振荡器中酶解10 h。10 h 后取出煮沸灭酶，待冷却至室温后，用高速冷冻离心机8000 r/min 离心5 min，取上清液。

1.2.6.2 酒精发酵实验从冷冻甘油菌液中沾取划线YPD 平板，置于30 ℃恒温培养箱培养2～3 d，获得酿酒酵母菌株单菌落。挑取单菌落接种于3 mL YPD 液体培养基中，30 ℃，240 r/min 培养24 h。菌液12000 r/min，离心5 min，去上清，用无菌水冲洗两次，按10%接种量接种到上述优化后酶解液中，30 ℃，240 r/min 摇瓶培养。发酵过程中，每隔4 h 取样一次直至发酵60 h[27]。发酵结束后，8000 r/min 离心5 min 取上清液冷冻保存。

1.2.6.3 发酵液中酒精和葡萄糖含量测定用高效液相色谱法[28]测定发酵液中葡萄糖含量和酒精，并计算酒精原料得率和葡萄糖制乙醇转化率。色谱条件：检测器为示差检测器；色谱柱为Biorad HPX-87H；流动相为5 mmol/L 稀硫酸-水溶液；流速为0.6 mL/min；柱温为65 ℃；进样量为20 μL，每个样品收集时间为25 min。葡萄糖转化率、酒精原料得率和葡萄糖制乙醇转化率[29]计算公式如下：

式中：Cg 为所得葡萄糖浓度，g/L；V 为酶水解的体积，L；M 为干B 淀粉量，g；W 为干燥B 淀粉释放葡萄糖的最大量，%；Ce 为乙醇浓度，g/L；0.51 为葡萄糖转化为乙醇的理论值。

1.3 数据处理

实验重复三次以上，实验数值以平均值±标准差表示，利用Excel、IBM SPSS Statistics 26 对数据进行处理并利用GraphPad Prism 9 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 小麦B 淀粉的各组分含量

对小麦B 淀粉的各组分含量进行分析，结果见表2。由表2 可知，B 淀粉中含一定非淀粉物质，蛋白质和灰分均在2%左右，戊聚糖含量接近5%，这些是影响淀粉品质的主要因素，尤其是蛋白质和戊聚糖含量[30]。据研究，戊聚糖具有较强的胶凝性和黏性[31-32]，是造成B 淀粉浆粘性大，在制糖浆时过滤困难的主要原因之一，也是限制B 淀粉加工利用的一个因素。淀粉作为小麦B 淀粉中的最重要成分，含量达85.61%，是利用小麦B 淀粉进行酶解产糖的主要来源，同时也说明了其作为酒精发酵底物的潜力。

表2 小麦B 淀粉各组分含量（%）Table 2 Content of each component of wheat B starch (%)

2.2 单因素实验结果

2.2.1 酶添加量对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响考察复合酶添加量对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响。结果如图1 所示，酶添加量在3 mL 时，淀粉水解效率最为显著（P＜0.05）。这是因为随着酶添加量的增加，酶与底物的接触机会增多，加速B 淀粉水解，DE 值随之增加。酶添加量在此基础上再增加时，DE 值保持不变，推测酶量已经达到饱和，由此可知复合酶溶液为3 mL 时为最优添加量，即α-淀粉酶添加量为36 U/g、糖化酶添加量为225 U/g，此时DE 值为85.91%。

图1 酶添加量对DE 值的影响Fig.1 Effect of enzyme addition on DE value

2.2.2 料液比对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响考察料液比对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响，由图2 可以看出，料液比为1:20 g/mL 时，小麦B 淀粉酶解产糖的效果最好，DE 值达到87.34%。在一定范围内，随着底物浓度增加，在这个范围内酶处于过量阶段，酶与底物接触范围变大，使淀粉水解程度增大，DE 值随之升高；但底物浓度过高时，会抑制酶的活性，导致DE 值降低[33]。因此选择料液比为1:20 g/mL 进行后续正交试验。

图2 料液比对DE 值的影响Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on DE value

2.2.3 酶解温度对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响考察酶解反应温度对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响，结果如图3 所示，50～60 ℃时，酶的活性随着温度的升高逐渐增大，60 ℃时DE 值达到最高值82.77%；高于60 ℃时，超过酶的最适工作温度，酶的活性降低，DE 值呈下降趋势。与先前研究一致，两种酶同时作用于淀粉水解，在60 ℃时葡萄糖释放量最高[34]，因此选择60 ℃的最佳温度进行后续正交试验。

图3 温度对DE 值的影响Fig.3 Effect of temperature on DE value

2.2.4 酶解时间对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响考察酶解时间对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响，由图4 可见，随着酶解时间的延长，DE 值显著增加（P＜0.05）。当酶解时间小于6 h，酶解时间过短，小麦B 淀粉酶解不完全，无法充分利用酶的效果，DE 值较低。反应时间10 h 时，DE 值达到88.59%，超过10 h 后，DE 值无显著变化。为了考虑时间的成本，选择10 h 进行后续试验。

图4 反应时间对DE 值的影响Fig.4 Effect of time on DE value

2.2.5 pH 对小麦B 淀粉酶解产糖效果的影响由图5 可以看出，pH 为5 时，此时水解效率最为显著，DE 值达到76.91%，这是因为pH 过高或过低都会导致酶活力下降[35]。在pH 小于5 时，随着pH 的升高，还原糖量逐渐增多；而当pH 高于5 时，随着pH 的升高，小麦B 淀粉酶解产生的还原糖含量下降，DE 显著降低（P＜0.05）。因此选择pH 为5 时进行后续试验。

图5 pH 对DE 值的影响Fig.5 Effect of pH on DE value

2.3 正交试验结果

为了优化小麦B 淀粉酶解工艺，将复合酶用量、pH、温度、料液比及时间这5 个因素进行正交试验，以DE 值为评价指标，实验结果如表3 及表4 所示。其中试验14 中所利用条件，DE 值可以达到89.01%±1.4%。从各个因素的不同水平分析可以得到，各个因素影响DE 值顺序分别为A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C2＞C1＞C3、D3＞D2＞D1、E2＞E3＞E1，因此可以确定小麦B 淀粉酶解产糖最佳工艺条件为A3B3C2D3E2，即最佳酶解产糖工艺的最佳条件是复合酶添加量4 mL（α-淀粉酶添加量48 U/g，糖化酶添加量300 U/g），料液比1:25 g/mL，酶解温度60 ℃，酶解时间10 h，pH=5。在最佳工艺条件下进行三次平行测定实验，DE 值达到94.60%±1.40%，大于正交试验结果的最高值89.01%±1.40%，说明本参数条件可提高小麦B 淀粉酶解产糖效率。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 正交试验方差分析Table 4 Analysis of variance for orthogonal experiments

2.4 B 淀粉酶解前后扫描电镜分析

利用扫描电镜对酶解前后小麦B 淀粉进行分析，结果如图6 所示。从图6a 中可以观察出，酶解前的小麦B 淀粉以小颗粒为主，还含有较大的损伤淀粉颗粒。图6b 是经α-淀粉酶和糖化酶酶解后的样品，从图中可以观察到淀粉颗粒形态发生了明显变化，球形淀粉颗粒观察不到，在α-淀粉酶和糖化酶作用下淀粉被完全水解[36]。

图6 小麦B 淀粉酶解前后电镜图Fig.6 Scanning electron microscopy (SEM) of wheat B starch before and after enzymatic hydrolysis

2.5 使用小麦B 淀粉酶解糖液酒精发酵

使用酿酒酵母对小麦B 淀粉酶解液发酵，酶解液中葡萄糖初始浓度29.343 g/L（表5），随着发酵时间地进行，葡萄糖含量逐渐下降，酒精浓度逐渐升高，最终酒精浓度达到12.761 g/L，酒精原料得率为31.90%±0.28%，如表5 及图7 所示。该结果证明了利用一步酶解发酵小麦B 淀粉生产酒精的潜力，为B 淀粉废弃资源利用提供了参考价值。

图7 酿酒酵母发酵小麦B 淀粉酶解液生产酒精糖降解及酒精生成情况Fig.7 Fermentation of wheat B starch hydrolysate by brewing yeast to produce alcoholic sugar degradation and alcohol production

表5 利用小麦B 淀粉酶解液发酵生产酒精Table 5 Alcohol production by fermentation using enzyme digest of wheat B starch

3 结论

本研究采用一步酶解法水解小麦B 淀粉，系统考察了酶添加量、酶解时间、pH、料液比、温度对还原糖得率的影响。利用正交工艺进行参数优化，采用价格比较便宜的中温α-淀粉酶和糖化酶酶解淀粉得出了最佳工艺条件：α-淀粉酶用量48 U/g，糖化酶用量300 U/g，pH5，酶解温度60 ℃，料液比1:25 g/mL，酶解时间时间10 h。在该条件下，DE 值为94.6%。使用酿酒酵母菌株发酵酶解液生产酒精乙醇可获得12.76 g/L，酒精原料得率可达31.28%。本研究开发了一步酶解制备可发酵糖用于生产酒精的简便方法，不仅可以减少资源浪费，提高经济效益，同时也可以拓宽酒精生产原料。