煮制压力和保压时间对鸡肉肌原纤维蛋白结构的影响

2024-05-12王昱苏查恩辉

食品工业科技 2024年10期

何珊，王昱苏，张硕，金嫘，查恩辉

（锦州医科大学食品与健康学院，辽宁锦州 121000）

鸡肉是人类最主要的膳食蛋白质来源之一，鸡肉中的脂质含量较低，富含多不饱和脂肪酸[1]，具有理想的营养特性和多种保健功能，如温补气血、补精补髓、强健筋骨等[2]。此外，因低胆固醇、价格低廉、没有文化和宗教限制等特点，鸡肉在全球范围内的消费量不断增加[3-4]。在发达国家，消费者越发重视肉类的质量安全和营养健康[5-6]。鸡胸肉作为其最大的主要部位，烹饪方便快捷，有一定市场前景[7]。脂质以及蛋白质发生氧化损伤是影响肉制品保质期和营养价值的主要原因[8-9]。肌肉内脂肪含量和肌肉纤维类型是影响各类肉质口感、嫩度和多汁性等特征的主要因素[10-11]。

在肉制品的热处理方式中常压蒸煮和高压煮制是世界范围内广泛使用的肉类加工技术[12]。代媛媛等[13]研究发现不同的煮制温度和保温时间对鸡胸肉嫩度和蒸煮损失率均产生明显的影响。刘晶晶等[14]研究表明随着加热的时间和温度的增大，牛肉的剪切力值降低，蒸煮损失率增加，水分含量下降。Zielbauer 等[15]研究发现，煮制猪肉时，蒸煮损失和煮制时间和温度呈正相关，水分损失主要出现在240 min 内、煮制温度大于60 ℃时。近年来，关于高压技术在改善肉类品质方面的研究日益广泛。郑海波[16]的研究表明，对鸡肉糜进行较长时间的高压处理能提高肉的嫩度，这是由于压力作用下肌肉肌节结构被破坏，肌纤维结构也产生变化。虽然高压对肉品嫩化起到优化作用[17]，但高压技术在工业实施中成本较高，设备成本与其经济产出不平衡，并且伴随着强烈的脱色反应[18]，而肉类颜色作为肉类新鲜度和质量的重要指标之一，会大大减少消费者购买欲望[19]。相比于高压煮制，微压煮制可以更少地损害食品营养和风味，同时缩短加热煮制时间。目前微压煮制主要应用在米饭、豆浆熟制方面，对食品品质具有改善作用[20-21]。鸡肉中的蛋白质是人类所需的必需氨基酸和营养物质的来源之一。蛋白氧化不仅会改变蛋白质的一些功能特性和质构特征，还会对肉品中的蛋白质微观结构产生影响，进而对肉制品加工产生一定的影响。对比已有研究发现，微压煮制对食品品质的效果更好，但对于微压煮制对鸡肉肌原纤维蛋白的影响研究在国内外较少且不深入。

因此，本研究的目的是对比常压煮制、微压煮制、高压煮制对鸡胸肉的蛋白质结构及氧化稳定性的影响，找到最佳的煮制工艺参数，明确微压煮制的特点及优势，为酱卤鸡肉预制产品的生产提供数据参考和技术支持。以鸡肉蛋白质氧化为标准对鸡肉进行评价，为更低成本、更高效率地获得高品质鸡肉提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡胸肉（新鲜）购于锦州市比优特超市；磷酸溶液、氯化钠、氯化镁、氢氧化钠等试剂国药集团化学试剂有限公司；浓盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸胍、甲醇、溴化钾、乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）等试剂天津博迪化工有限公司；磷酸二氢钾、溴酚蓝、2,4-二硝基苯肼、磷酸氢二钾、乙酸乙酯、三氯乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）等试剂恒兴化学试剂制造有限公司；所有试剂均为分析纯。

FA1004 电子天平青岛聚创环保集团有限公司；KH20R 高速冷冻离心机上海双旭电子有限公司；CH6 数字显示温度计广州海伦仪器仪表有限公司；JJ-2 高速匀浆机上海启前电子科技有限公司；HH-WO 恒温水浴锅山东千司科学仪器有限公司；U-T6 紫外可见分光光度计让奇（上海）仪器科技有限公司；V-PHSJ-5 型pH 计上海熠昕电子科技有限公司；W-Great20 傅立叶红外光谱仪中科瑞捷科技有限公司；X-FD-1A-50 冷冻干燥机杭州汉德空分设备有限公司；JSM-IT200 扫描电子显微镜惠州市华高仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理用流水将肉表面洗干净，均匀切割为4 cm×3 cm×3 cm 的小块，放在烧杯内，用保鲜膜盖紧，在4 ℃的冰箱中保存。

1.2.2 鸡肉煮制处理常压煮制处理：将肉样放入装有500 mL 的烧杯中，再放入85 ℃恒温水浴锅中，用电子温度记录仪检测肉块中心温度达到72 ℃。

微压样品处理：将被测肉样放入微压锅，压力为4 kPa。

高压样品处理：把被测试的肉样放入高压锅，压力为70 kPa。

保压时间分别为15、20、25、30、35 min，完成后取出冷却至室温[22]。

用吸水纸吸干肉样表面汁液，测定其余指标。实验进行三次独立重复测定。

1.2.3 肌原纤维蛋白的提取参考文献[23-24]方法稍作修改。称取肉样，添加其四倍量的4 ℃提取液（10 mmol/L 磷酸缓冲溶液，其中包括100 mmol/L NaCl、1 mmol/ EDTA 以及2 mmol/L MgCl2，pH7.0），混合摇匀后进行匀浆，匀浆120 s 后在3500 r/min、4 ℃下离心15 min。取沉淀，将匀浆反复离心三次，于以上条件下弃去上清液，得到的沉淀以四倍量4 ℃洗液洗涤（25 mmol/L 磷酸盐缓冲液，含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）反复洗涤三次后过滤，用0.1 mol/L HCl 将滤液pH 调节至6.0，所得滤液在3500 r/min和4 ℃的条件下再次离心15 min。所得沉淀放入封闭瓶内，4 ℃保存，待用。采用牛血清蛋白作标准，540 nm 处测其吸光度和双缩脲法检测蛋白浓度（y=0.0485x+0.0032，R2=0.9997）。

1.2.4 羰基含量的测定参考Pérez-Alvarez 等[25]方法稍加修改。取1 mL 质量浓度为2 mg/mL 的蛋白溶液和1 mL 浓度为0.01 mol/L 的2,4-二硝基苯肼溶液（DNPH，溶剂为2 mol/L HCl），空白样品不加DNPH，暗室避光反应1 h，每次间隔20 min 振荡1 次，加1 mL TCA 溶液，摇匀后离心，在10000 r/min，4 ℃条件下离心15 min，除去上清液。得到的沉淀使用1 mL 乙酸乙酯-乙醇溶液（V/V=1:1）清洗3 次。再加入5 mL 6 mol/L 的盐酸胍溶液，于38 ℃水浴条件下反应20 min，随后在10000 r/min 和4 ℃的条件下继续离心5 min。在370 nm 波长处测定吸光度，羰基含量通过22000 L/（mol·cm）的摩尔吸收率计算。

式中：A370为370 nm 下的吸光度；n 为稀释倍数；106为摩尔基础单位；C 为测得的蛋白浓度（mg/mL）。

1.2.5 巯基含量的测定参考Yang 等[26]方法稍加修改。取蛋白溶液用0.1 mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.4）稀释为质量浓度2 mg/mL，所得溶液取0.5 mL 于试管中，加入2.0 mL 尿素-SDS 溶液和0.5mL DTNB 溶液，混合摇匀，室温下置于暗处反应25 min，在412 nm 处测定吸光度。巯基含量由11400 L/（mol·cm）的摩尔吸收率计算。

式中：A412为412 nm 下的吸光度；n 为稀释倍数；106为摩尔基础单位；C 为测得的蛋白浓度（mg/mL）。

1.2.6 扫描电镜观察参考孙慧琳[27]的方法稍加修改。将鸡肉样品沿肌纤维方向切成0.1 cm×0.1 cm×0.2 cm 的小肉片，用2.5%戊二醛浸泡12 h，加入0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液浸泡固定3 次，每次20 min；完成后进行梯度脱水，分别用30%、50%、70%、80%和90%的乙醇，每次15 min，再用无水乙醇进行脱水两次，每次15 min；最后，在冷冻干燥及金喷涂后用扫描电镜观察并拍摄肉样结构。

1.2.7 傅里叶变换红外光谱测定参考Yang 等[28]方法稍加修改。在-20 ℃的条件下冷冻蛋白样品5 h，之后取出冷冻干燥12 h，称量1 mg 所得样品向其中加入100 mg 溴化钾，于研钵内充分研磨。将所得粉末均匀平铺模具中并横向置于模座内，加压至10 t/cm2，保持1 min，用傅里叶红外光谱仪进行分析，条件为：光谱范围：500～4000 cm-1，分辨率：4 cm-1，扫描积累32 次。

1.3 数据处理

每组实验均重复3 次以上，采用SPSS 26 对数据处理和方差分析，多重比较采用Duncan 法，并采用Origin2021 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 煮制压力对鸡肉蛋白羰基含量的影响

在蛋白质的氧化性反应中，最常见的指示剂是羰基的含量，鸡肉内羰基直接被蛋白质侧链上的氨基酸氧化或主肽链发生断裂而产生，也可由于鸡肉被氧化而产生非蛋白羰基化合物。这类氨基酸侧链直接氧化是目前公认的生成蛋白质羰基衍生物最重要的方法[29]，结果见图1。

图1 不同压力及时间对蛋白羰基含量的影响Fig.1 Effects of different pressure and time on protein carbonyl content

由图1 可知，保压时间为15～35 min 时，常压煮制下羰基含量从0.86 nmol/mg 增加到1.91 nmol/mg，增加了1.22 倍；微压煮制下羰基含量从1.14 nmol/mg 增加至2.71 nmol/mg，增加了1.38 倍；高压煮制下羰基含量从1.33 nmol/mg 增加至2.91 nmol/mg，增加了1.19 倍。三种压力下随着保压时间的增加羰基含量均升高，原因是脂质氧化的产物与肌原纤维蛋白相结合，使得蛋白质羰基的含量升高，而在鸡肉中较少的脂肪发生氧化反应，也会引起羰基的升高[30]。

2.2 煮制压力对鸡肉蛋白巯基含量的影响

蛋白质的高级结构主要通过分子间各种作用力共同形成，其中二硫键对蛋白质的一级、二级和三级结构的稳定性都起着重要的作用[31]。二硫键与巯基之间是一种动态的相互转化关系。蛋白质之间疏水性质、相互作用力等功能的改变是代表蛋白质变性情况的主要指标，其改变的主要原因之一是二硫键与巯基的共价交联与断裂改变蛋白质的作用力情况并影响蛋白质结构[32]。巯基有维持蛋白质结构及功能特性的作用，属于功能基团中活性较强的一类基团，结果见图2。

图2 不同压力及时间对蛋白巯基含量的影响Fig.2 Effects of different pressure and time on protein sulfhydryl content

由图2 可知，常压煮制时间为15～20 min 时，巯基含量从68.5 nmol/mg 增加至78.4 nmol/mg，继续延长保压时间至35 min，巯基含量下降到55.2 nmol/mg，下降了29.6%。当煮制时间持续延长，巯基含量先上升再下降，这是因为肉样受热影响了肌动球蛋白的解离程度，当保压时间达到20 min 时肌动蛋白最大程度解离，巯基含量在此时达到最高，继续煮制后改变了肌动球蛋白构象，巯基氧化生成为二硫键[33]，使得巯基含量降低。微压煮制下，保压时间为15～35 min，巯基含量从76.1 nmol/mg 减少至53.4 nmol/mg，下降了29.8%。高压煮制下，保压时间为15～35 min 时，巯基含量从70.4 nmol/mg 减少至48.3 nmol/mg，下降了31.4%。高压及微压条件下，当保压时间延长，巯基含量同步减少，原因是压力处理使肌原纤维蛋白展开，更多隐藏的巯基暴露，增加疏水性，使分子间巯基间距变小，促进二硫键的形成，致使巯基减少[34]。

2.3 煮制压力对肌纤维微观结构的影响

采用最佳加工工艺组合处理鸡胸肉，同时进行对照处理（生鸡胸肉）。不同的煮制压力下各组鸡胸肉的扫描电镜图结果见图3。

图3 鸡胸肉的微观纤维结构图（5000×）Fig.3 Microscopic fiber structure of chicken breast (5000×)

图3A 为对照组生鸡胸肉样品的肌纤维结构图，可以看出生鸡胸肉肌纤维空隙较小，组织结构致密且有序，纹理清晰，肌束膜以及肌内膜的结构比较完整，具有疏松的网状结构。图3B 为常压煮制下鸡胸肉样品的肌纤维结构图，与生鸡肉样品相比，常压煮制下鸡胸肉样品表面纹理模糊，膜结构开始出现部分断裂崩解，有细微颗粒化物质出现，结构的有序度被破坏；图3C 为4 kPa 微压煮制下鸡胸肉样品的肌纤维结构图，可以看出鸡胸肉的肌纤维与常压煮制下鸡胸肉样品类似，但在肌纤维空隙中呈现出更明显的颗粒化物质；图3D 为70 kPa 高压煮制下鸡胸肉样品的肌纤维结构图，相较于常压蒸煮及微压煮制，高压煮制下鸡胸肉中肌纤维结构被完全破坏，肌节断裂，几乎看不到颗粒化物质，绝大部分肌束膜裂解，基本完全消失。综上所述，经三种不同压力煮制后的鸡胸肉结构被破坏程度大小为高压煮制＞微压煮制＞常压煮制。

2.4 煮制压力对肌原纤维蛋白二级结构的影响

傅里叶变换红外光谱用于分析蛋白质二级结构，可定量分析蛋白各二级结构含量[35]，各子峰与其二级结构的对应关系如下：1615～1637 cm-1为β-折叠；1637～1645 cm-1为无规则卷曲；1646～1661 cm-1为α-螺旋；1660～1695 cm-1为β-转角[24]。在此基础上，通过对不同水煮压力下的傅里叶光谱数据进行基线修正，然后通过计算二阶导数和去卷积等方法剔除多余的子峰，最后通过Peakfit 拟合得到最小的剩余值。根据其峰面积来计算各类二级结构比率，结果如图4～图6。

图4 常压煮制下不同时间对鸡胸肉肌原纤维蛋白的二级结构相对含量图Fig.4 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under atmospheric pressure cooking

图5 微压煮制下不同时间对鸡胸肉肌原纤维蛋白的二级结构相对含量图Fig.5 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under micro-pressure cooking

图6 高压煮制下不同时间对鸡胸肉肌原纤维蛋白的二级结构相对含量图Fig.6 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under high pressure cooking

由图4～图6 可知，不同煮制压力下，肌原纤维蛋白的二级结构含量随保压时间延长发生的变化不相同。在常压煮制下，保压15～35 min 时，α-螺旋的百分比含量从28.74%下降至10.52%，β-折叠的百分比含量从18.13%增加至57.42%，无规则卷曲的百分比含量从20.59%增加至45.5%，β-转角从11.48%增加至13.53%。随着压力保持时间的延长，α-螺旋的含量降低，β-折叠、无规则卷曲和β-转角的含量则增加。在微压煮制下，保压15～35 min，α-螺旋含量由27.16%降低至9.63%；无规则卷曲含量从27.46%增加至46.69%；β-转角呈波动性变化；保压15～35 min，β-折叠含量呈明显上升趋势，由28.52%升高至45.09%。在高压煮制下，保压15～25 min，β-折叠含量从30.03%增加至58.01%，直到35 min，β-折叠含量下降至43.23%；当保压15～35 min 时，无规则卷曲含量从28.70%增加至58.61%，α-螺旋含量由25.74%减小到8.05%，β-转角含量随时间延长波动。

总的来说，保压时间的持续延长导致β-折叠和无规则卷曲的含量逐渐升高，α-螺旋含量逐渐降低，造成这种现象的原因是压力的增长以及保压时间的延长促进肌原纤维蛋白的α-螺旋向β-折叠和无规则卷曲转换[36]。α-螺旋是一种由分子中的氢键形成的有序结构。在不同的煮制压力下，随着保压时间的增加，α-螺旋的含量都有所下降，这说明加热可以削弱保持α-螺旋结构的氢键作用，从而对蛋白质的去折叠起到了促进作用；β-折叠结构也是一种由分子间的氢键维持的有序排列，当它被加热后，它的含量会增加，这就意味着分子间的氢键作用会加强，从而导致它的聚集程度会变得更大[37]。此外，高压煮制过程中β-折叠的含量呈先增加后减少的趋势，而水的分子因高压煮制的后期会随着二级结构的膨胀而迁移，疏水基团与巯基的接触为蛋白质提供了更大的空间，蛋白质在这个过程中逐渐发生团聚，β-折叠结构也开始解体，分子之间疏水作用也开始产生无规则卷曲[38]。

3 结论

随着保压时间的延长，羰基含量呈现上升趋势，常压、微压、高压煮制羰基含量分别增加了1.22 倍、1.38 倍、1.19 倍，巯基含量呈下降趋势，常压、微压、高压煮制巯基含量分别减少了29.6%、29.8%、31.4%；随着保压时间的延长肌原纤维蛋白二级结构中β-折叠含量和无规则卷曲含量增加，α-螺旋含量降低；对鸡胸肉蛋白结构的破坏程度为高压＞微压＞常压。本研究结论明确了不同煮制压力下蛋白质氧化规律，下一步将蛋白氧化程度与鸡肉的食用品质进行相关性分析，为优化煮制的方法和工艺参数提供参考依据。