防治松材线虫病的一种新型复配注干剂增效配比筛选1)

张娇 张婉君 叶建仁

(南京林业大学,南京,210037)

松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)是常见的松树寄生性线虫,能引发松材线虫病。松材线虫病是松树的一种破坏性流行病害,自1982年在我国首次发现以来,迅速蔓延,造成了严重的经济损失[1]。在过去几十年中,国内外学者研究开发了多种防治措施阻遏松材线虫病的发生扩散,例如,通过移除受感染的树木来物理根除,空中施用杀虫剂以杀死线虫的媒介(墨天牛属),使用防治松材线虫树干注射剂以控制线虫本身[2],但很多方法成本较高、防治效果差,大面积推广应用存在较大的难度。

近年来,打孔注药技术防治松材线虫病取得了不错的防控进展,由于树干注药能够对树体内的线虫有着直接毒杀作用,而且对环境友好,因此这种措施在我国被广泛采用[3]。目前,市面上应用最广泛的注干剂是甲维盐,因其防治效果好,施用效率高,得到了一致的认可[4-5]。除此以外,阿维菌素使用的频率也很高,林茂松等[6]引入了日本的一种阿维菌素注干剂,在国内松林中进行试验,结果表明,该药剂注干后,2～3个月对松材线虫病的防效达到100%,防治效果取得了良好的成绩。但是,长期重复、单一的使用这两种药剂,容易使松材线虫产生耐药性。不同药剂的合理复配不仅能提高对靶标生物的防治效果,并且对其耐药性的产生具有一定的延缓作用[7]。

氟吡菌酰胺是拜耳公司研发的1种新一代优秀杀菌剂,近年发现其还兼具杀线功能[8]。氟吡菌酰胺是作用于线粒体呼吸电子传递链上的复合体Ⅱ(即琥珀酸脱氢酶,SDH)或琥珀酸辅酶Q还原酶(SQR),主要起到抑制呼吸系统的作用[9]。甲维盐是微生物源杀虫剂,其作用机理是阻断害虫的运动神经功能,起到抑制神经功能的作用[10]。已有学者通过试验研究表明,将具有不同作用机理的两种药剂进行合理的复配,可达到更好的致死效果[11]。因而,为了明确这两种药剂在不同配比时的联合毒力效果,本研究在测定氟吡菌酰胺和甲维盐两种药剂对松材线虫室内毒力的基础上,设置不同的配比,并以Sun et al.[12]的共毒系数法筛选出具有增效的配方组合,进一步探究增效效果较好的药剂配比对松材线虫产卵孵化的影响,旨在为松材线虫复配药剂的合理选用提供参考。

1 材料与方法

供试虫源:松材线虫强毒虫株AMA3,保存于南京林业大学实验室。

供试药剂:质量分数96%的氟吡菌酰胺原药(杭州益森键生物科技有限公司),质量分数72.27%的甲维盐原药(江苏功成生物科技有限公司)。

线虫的培养与获得:将在冰箱中4 ℃保存的松材线虫AMA3虫株接种到长满灰葡萄孢菌丝的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上,随后放置在恒温培养箱中25 ℃培养5～7 d,待线虫将菌丝取食干净,利用贝尔曼漏斗法收集松材线虫,将收集到的松材线虫液体以3 500 r·min-1离心3 min,反复冲洗3次,并将其配制成所需要的线虫悬浮液。

虫卵的培养与获得:吸取足量的线虫于培养皿内,让性成熟的雌成虫和雄成虫自由交配并产卵,放置在恒温培养箱中25 ℃培养2～3 h,待卵产出后,将线虫倒掉,保留皿底的虫卵,利用高温灭菌过的毛刷,将皿底的虫卵收集起来,将其配制成所需的虫卵悬浮液。

不同药剂对松材线虫毒力的测定:采用浸虫法探究两种原药室内对松材线虫的毒力。将供试药剂用N-N二甲基甲酰胺配制成母液,再用吐温-80水溶液将母液等比稀释成5个供试质量浓度。每个质量浓度为一个处理,每个处理重复5次,以无菌水为对照1,以N-N二甲基甲酰胺和吐温-80配制成的水溶液为对照2。将药液和虫液按照体积比1∶1混合加入1.5 mL离心管中,将所有离心管置于恒温培养箱中25 ℃培养,24 h后,在显微镜下观察统计线虫的存活数和死亡数。由于松材线虫存在假死现象,在判断其生命时,虫体摆动呈“S”形、螺旋形、卷曲形判为活虫;虫体僵直不动呈“J”形、“C”形,体表无光泽并且用昆虫针反复刺激,若仍僵直不动,则可判为死虫[13]。

校正死亡率=[(处理组死亡率-对照2组死亡率)/(1-对照2组死亡率)]×100%。

复配药剂室内联合毒力测定:采用交互测定法[14],将两种药剂按照不同的比例进行混合,得到混配药剂,将其等比设置5个质量浓度梯度,按照上段方法进行毒力测定,求出致死中质量浓度(LC50),测定出其对松材线虫的联合毒力,评判方法依据Sun et al.[12]的共毒系数(CTC)法,筛选出共毒系数大于120的增效配比。评价标准为:共毒系数>120为增效作用;共毒系数<80为拮抗作用;80≤共毒系数≤120为相加作用。

单剂毒力指数=(标准药剂LC50/供试单剂的LC50)×100。

混剂(A+B)理论毒力指数=A剂的毒力指数×A剂在混剂中的质量占比+B剂的毒力指数×B剂在混剂中的质量占比。

混剂(A+B)实测毒力指数=[标准药剂的LC50/混剂(A+B)的LC50]×100。

共毒系数=[混剂(A+B)实测毒力指数/混剂(A+B)理论毒力指数]×100。

不同药液配比时松材线虫产卵量测定:利用贝尔曼漏斗法收集松材线虫,将其配制成每20 μL含50雌雄成虫的线虫悬浮液。将线虫液和药液按照体积比1∶1混匀,加入1.5 mL离心管中,每个配比重复5次,以无菌水作为对照1,以N-N二甲基甲酰胺和吐温-80水溶液为对照2。将虫液浸泡12、18、30 h,在不同时间段观察各配比线虫产出卵的数量。

不同药液配比时松材线虫卵孵化率测定:将不同配比的药液分别和虫卵悬浮液(50～60个/10 μL水溶液)按体积比1∶1混匀,放置在1.5 mL离心管中,每个配比重复5次,以无菌水作为对照1,以N-N二甲基甲酰胺和吐温-80水溶液为对照2。浸泡12、18、30 h,在不同时间段观察各配比孵化出幼虫及卵的数量。

虫卵孵化率=[幼虫数/(卵数+幼虫数)]×100%。

数据处理:试验数据选用WPS 2019软件整理;利用DPS软件和机率值分析法对药剂进行毒力回归分析,计算致死中浓度(LC50)及其95%置信区间。利用SPSS软件进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对松材线虫的毒力效果

两种不同药剂在24 h后,对松材线虫的毒力分析结果如表1所示,氟吡菌酰胺的LC50为4.071 5 μg/mL,毒力作用明显高于甲维盐(2 159.885 4 μg/mL)。

表1 不同药剂对松材线虫毒力分析结果

2.2 复配药剂联合毒力效果

由表2可知,在7个复配组合中,共毒系数大于120的有5对配比,其中,氟吡菌酰胺和甲维盐以质量比3∶5混合时,共毒系数(CTC)为334.673 1,在7组不同配比中达到最高,增效作用最为明显。质量比在5∶3、2∶6时,共毒系数(CTC)值分别为159.768 2、215.704 1,2个比例也表现出较高的增效作用。质量比在4∶4、1∶7时,共毒系数(CTC)值分别为126.850 2、122.429 5,表现出增效作用。在质量比为6∶2、7∶1时,均表现为相加作用,共毒系数(CTC)值分别为104.113 6、99.308 1。

表2 复配药剂联合毒力分析结果

2.3 药液在不同配比时对松材线虫产卵的影响

由表3可知,对照1为纯水处理组,对松材线虫的产卵能力没有影响,随着处理时间的延长,产卵逐渐增多。对照2与对照1结果无显著差异,表明N-N二甲基甲酰胺和吐温-80水溶液对松材线虫产卵基本无影响。经过氟吡菌酰胺和甲维盐单剂处理过的松材线虫,在处理18 h时的产卵量分别107.33、56.67粒,在处理30 h时的产卵量分别为78.67、46.00粒,显著低于对照1、对照2。配比组合5∶3在处理12、18、30 h时的产卵量分别为35.67、35.00、33.67粒,质量比为3∶5的组合在处理12、18、30 h时的产卵量分别为27.67、22.33、21.00粒,质量比为2∶6时,在处理12、18、30 h时的产卵量分别为28.00、26.67、24.33粒,均呈现下降趋势。经过不同药剂处理后的松材线虫,在不同处理时间的产卵量表现为,对照1、对照2高于氟吡菌酰胺单剂、甲维盐单剂,2种单剂高于复配药剂,复配药剂抑制松材线虫产卵能力达到最高,差异显著(P<0.05),且在3个时间段内,质量比为3∶5的处理产卵量均达到最低。

表3 不同处理在不同处理时间松材线虫的产卵量

2.4 药液在不同配比时对松材线虫卵孵化率的影响

由表4可知,随着处理时间的延长,卵孵化率呈现逐步上升趋势,对照1和对照2在3个处理时间之间均无显著差异。氟吡菌酰胺和甲维盐2种单剂处理对卵孵化具有一定的抑制效果,其中,甲维盐单剂处理对卵孵化抑制效果更好,在处理12、18、30 h时的孵化率分别为50.50%、54.40%、60.10%。复配处理的卵孵化率显著低于2种单剂处理,质量比为5∶3、3∶5、2∶6处理的松材线虫,在处理12 h时,孵化率最低,分别为27.36%、18.91%、22.11%,抑制效果远高于对照1和对照2,且高于2种单剂处理。质量比为3∶5的处理在处理12、18、30 h时的孵化率均达到各处理中的最低值,分别为18.91%、27.18%、28.87%。

表4 不同处理在不同处理时间松材线虫的卵孵化率

3 结论与讨论

通过两种药剂单独使用时的杀线效果发现,氟吡菌酰胺对松材线虫的杀线效果更好,且目前这种药剂对松材线虫的作用研究结果较少,具备成为一种新的防治松材线虫注射剂的潜力[15],其主要作用于靶标生物的呼吸系统[9]。甲维盐的作用机理是影响害虫体内的神经细胞功能,使害虫神经细胞中氯离子浓度升高,进而破坏神经传导功能,使害虫肢体发生麻痹[16],导致其致死中浓度偏高。

氟吡菌酰胺与甲维盐的的作用机理不同,两者复配可以实现不同的作用位点共同作用的效果,有效克服作用位点单一、产生抗药性突变等问题[17]。现阶段已有不少关于药剂联合使用的研究,如硫酸铜与溴氰菊酯、硫酸铜与阿维菌素以及涕灭威与溴氰菊酯对松材线虫的联合用药都能使对松材线虫的毒性增强[13]。也有研究发现,阿维菌素和吡虫啉联合染毒,对松材线虫也表现出增效作用[18]。本试验通过共毒系数法[12]对氟吡菌酰胺和甲维盐进行联合毒力测定,结果表明,7个混配比例中,除了氟吡菌酰胺和甲维盐质量比为7∶1和6∶2时,效果显示为相加作用外,其他5个复配比例效果均为增效。

为了进一步筛选出最佳的增效配比,将共毒系数高、增效作用明显的质量比组合3∶5、5∶3、2∶6,以及氟吡菌酰胺和甲维盐两种单剂进行松材线虫的产卵试验,发现经过不同药剂处理过的线虫产卵量和时间呈现正相关趋势,这是由于雌虫死亡率的上升以及卵正处于孵化时间内等原因导致,并且经过复配药剂处理后的松材线虫在不同处理时间的产卵量均低于两种单剂处理后的松材线虫的产卵量。

卵孵化率是体现松材线虫繁殖力的重要因素之一,25 ℃培养时,卵孵化为二龄幼虫需要25 h[19]。有研究发现,甲维盐处理过的卵孵化率低于氟吡菌酰胺处理过的卵孵化率[20]。质量比为3∶5、5∶3、2∶6时能大大降低松材线虫的卵孵化率,其中,质量比为3∶5时对卵孵化的抑制作用最大。

综合氟吡菌酰胺和甲维盐在不同配比时对松材线虫的杀线效果、共毒系数、产卵和卵孵化的研究结果发现,质量比为3∶5、5∶3、2∶6时都具有良好的防治松材线虫病的潜力,为后续防治松材线虫复配注干剂配方的筛选及林间应用提供了良好的理论基础。