黑龙江省松树天牛高致病力虫生真菌的筛选与鉴定1)

张瑶 宋小双 张值荣 刁桂萍 李亚洲 邓勋

(东北林业大学,哈尔滨,150040) (黑龙江省森林保护研究所) (东北林业大学) (黑龙江省森林保护研究所)

松树天牛主要危害松科、杉科植物,主要危害方式是通过幼虫钻蛀树干、枝条的韧皮部及木质部,破坏和切断输导组织,影响水分和养分运输,进而影响树木的生长,严重时可造成植株死亡[1]。松树天牛的部分种类是松材线虫病的传播媒介[2],松材线虫病的传播可对松林资源造成重大危害,因此有效防控天牛危害一直是我国森林保护的重要工作和研究重点[3]。

近年来,化学药剂的使用对控制天牛等害虫的种群密度具有良好的效果,赵鹏等[4]通过打孔注入吡虫啉或啶虫脒等内吸性较好的化学药剂对天牛进行防控;马海丽等[5]通过“树干注药+树冠喷药”的有机结合来防治黄斑星天牛;徐云等[6]使用“辛硫磷+克百威+橙皮桔油”直接喷干,防治光肩星天牛幼虫。目前,由于缺乏对化学药剂的有效安全管理策略,使用化学农药的负面影响会持续存在于土壤、湿地、地下水、非目标植物、脊椎动物的环境中[7],因此,利用生物防治害虫越来越受欢迎。虫生真菌具有寄主广、防治害虫不产生抗药性、对环境友好等优点[8],将其加工制作成真菌杀虫剂,可作为有毒化学杀虫剂的安全替代品[9]。

虫生真菌广泛分布于自然界中,能寄生于多种昆虫,且致病能力强、改良潜力大、对非靶标生物毒性低,是一种具有巨大开发潜力的环境友好型杀虫剂[10]。目前,已作为杀虫菌剂应用的昆虫病原真菌菌种包括球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)、罗伯茨绿僵菌(Metarhiziumrobertsii)、淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinum)、蜡蚧轮枝菌(Lecanicilliumlecanii)等。本研究从黑龙江省哈尔滨市、牡丹江市林区收集67份土样,使用黄粉虫诱集和稀释涂布平板法分离纯化出虫生真菌,通过逐步测定菌株对松树天牛幼虫、成虫的致病力筛选出高致病菌株,并结合形态学鉴定和构建系统发育树分析确定菌株分类地位,初步探究昆虫病原真菌防治松树天牛的潜力。

1 材料与方法

供试菌株:土壤样品于2021年8月份采自黑龙江省哈尔滨市、牡丹江市林区,使用黄粉虫诱集和稀释涂布平板法分离纯化获得纯菌株。将纯菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的试管斜面上,26 ℃恒温培养10 d后,放入冰箱内4 ℃保存。供试菌株详细信息见表1。

表1 供试菌株的基本情况

供试虫源:松树天牛幼虫于2022年4月份收集于野外的红松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)虫害木,通过木段解剖获取灰长角天牛幼虫共328只,实验时挑选活力好、虫龄一致的幼虫进行实验。松树天牛成虫于2022年5月份收集于野外的红松虫害木,将虫害木置于养虫笼内,待松树天牛成虫羽化后放入打孔塑料盒内,用新鲜松树枝条饲养,共获得灰长角天牛成虫372只,实验时挑选活力好且羽化日龄差异小的成虫进行实验。

不同浓度孢子悬液的制备方法:用体积分数为0.05%的吐温-80溶液洗脱平板上的孢子,并转移至装有玻璃珠的50 mL离心管中,然后用漩涡振荡器振荡,使孢子充分分散,用三层无菌纱布过滤,稀释后在显微镜下用血球计数板计数,计算母液的浓度,将母液稀释成孢子浓度为107个·mL-1的孢子悬液备用。取1 mL孢子浓度为107个·mL-1的孢子悬液,加入到9 mL体积分数为0.05%的吐温-80溶液中,将其稀释成孢子浓度为106个·mL-1的孢子悬液,再次稀释获得孢子浓度为105个·mL-1的孢子悬液。

虫生真菌菌株的筛选方法:将菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上,放入培养箱内26 ℃培养10 d。使用爬行法[11]接种,将5只松树天牛幼虫放进培养好菌株的平板内活动1 h,对照组放入无菌培养皿内1 h,然后将试虫转移到打孔且装有湿润木屑的10 mL无菌离心管内,每只松树天牛幼虫使用1个离心管,室温培养,每天观察试虫状态至6 d,试虫死亡后继续保湿培养,观察体表是否有菌丝长出,以确定是否被菌株感染致死。

将菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上,放入恒温培养箱内26 ℃培养10 d。使用爬行法接种,将3只松树天牛成虫放进培养好菌株的平板内活动1 h,对照组放入无菌培养皿内1 h,然后将试虫放入底部垫有3张湿润滤纸的组培瓶内,每2 d供应1根新鲜的松树枝条和补充0.5 mL无菌水作为食物和水源。每天观察记录试虫状态至6 d,试虫死亡后继续保湿培养,观察体表是否有菌丝长出,以确定是否被菌株感染致死。

不同菌株生长速度与产孢量的测定方法:用移液枪吸取20 μL孢子浓度为107个·mL-1的孢子悬液,滴至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中央,放入恒温培养箱内26 ℃培养,在5、10、15 d时,采用十字交叉法测量菌落直径。培养至15 d时,用体积分数为0.05%的吐温-80溶液将平板上所有孢子冲洗下来制成孢子悬液,使用漩涡振荡器振荡,使孢子充分分散后,在显微镜下用血球计数板计算孢子悬液浓度,然后计算产孢量,实验设3个重复。

不同浓度孢子悬液对松树天牛室内致病力的测定方法:利用M14-1、H2菌株,制备孢子浓度为107、106、105个·mL-1的孢子悬浮液,以体积分数为0.05%的吐温-80溶液为空白对照。采用浸液法[12],将松树天牛成虫放入孢子悬液中浸泡5 s后取出,用滤纸吸干多余水分,放到底部垫有1张湿润滤纸的组培瓶中,每2 d供应1根新鲜的松树枝条和补充0.5 mL无菌水。每2 d观察记录试虫的状态,试虫死亡后继续补充无菌水保湿,且每天移至体视显微镜下观察试虫体表菌丝生长情况,并记录试虫形态特征。实验设3个处理,每处理重复3次。

菌株M14-1、H2种类的鉴定方法:将分离得到的菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基内培养,5 d时挑取菌丝于载玻片上,在显微镜下观察并记录菌株产孢结构和孢子形态。培养至14 d时观察并记录菌落形态特征。然后用DNA提取试剂盒提取DNA,采用内转录间隔区(ITS)序列进行分子生物学鉴定。引物:ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)或ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’);反应体系(40 μL):2×20 μL的Taq Master Mix、2 μL的引物ITS1、2 μL的引物ITS4、2 μL的DNA模板、14 μL的ddH2O;PCR反应程序:94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,循环30次,72 ℃延伸5 min。聚合酶链式反应(PCR)扩增产物用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测,合格后送往睿博兴科生物技术有限公司进行序列测定。

数据处理:利用SPSS软件进行数据分析;利用DPS软件拟合毒力回归方程与计算半致死时间(LT50);并采用MEGA7.0软件构建发育树。

2 结果与分析

2.1 对松树天牛具有高毒力的虫生真菌菌株筛选

表2为菌株对松树天牛幼虫、成虫致病的累计死亡率和感染率。在松树天牛幼虫被接种4 d时,有16株菌接种的松树天牛幼虫出现僵虫。在接种6 d时,18株菌接种的松树天牛幼虫都出现了僵虫,表明这18株菌对松树天牛幼虫都具有致病力,其中菌株M8-2、M33-2、T11接种的松树天牛幼虫,在4、6 d累计死亡率分别达到了60%、100%,该菌株对松树天牛幼虫的致病力高于其他菌株;M14-1、H2、M3、M5等多种菌株在6 d时,累计死亡率均高达100%,感染率均达到80%及以上,对松树天牛幼虫致病力效果较好;菌株M25-3、M10的感染率未达到80%,通过观察,发现未被菌株感染的僵虫虫体变黑且流出浓液,其是受培养条件影响致死。

表2 菌株对松树天牛幼虫、成虫致病的累计死亡率和感染率

松树天牛成虫被接种3 d,有9株菌接种的松树天牛成虫出现僵虫。在被接种的6 d,18株菌接种的松树天牛成虫出现了僵虫,表明这18株菌对松树天牛成虫都具有致病力。其中菌株M14-1、M33-2、H2、Z1对松树天牛成虫致病力均高于其他菌株,被接种的松树天牛成虫在3、6 d累计死亡率分别达到66%、100%,且感染率均达到100%。菌株M10、M19-2、H1、T6-1对松树天牛成虫致病力效果次之,被接种的松树天牛成虫在3、6 d累计死亡率分别为33%、100%,感染率均达到100%(表2)。

松树天牛幼虫被菌株感染死亡后,试虫体表黄色变深,身体略微皱缩,接着试虫体表逐渐出现菌丝,且菌丝极易沾上木屑而影响观察;松树天牛成虫被感染后,试虫体表触角、足、基节、口器变得脆弱,且很快长出菌丝,随后菌丝逐渐长满全身。松树天牛幼虫、成虫被同一菌株感染后,菌丝、孢子堆的颜色、形态等基本特征变化不大(图1)。

图1 松树天牛幼虫、成虫被感染后的特征

2.2 不同菌株的生长速度与产孢量测定

表3为不同菌株菌落在5、10、15 d的直径及产孢量。其中菌株M14-1的菌落在三个时期的直径均显著大于其他菌株,在5、10、15 d时,其直径分别为2.50、4.13、5.68 cm;菌株H2的直径在5、10 d相比其他菌株没有明显优势,但在15 d时菌株直径仅次于M14-1。菌株M14-1、H2培养到15 d时的产孢量显著高于其他菌株,其中菌株M14-1的产孢量为3.86×108个·板-1,菌株H2产孢量为4.10×108个·板-1。

表3 菌落的直径与产孢量

总体上,菌株M14-1、H2对松树天牛幼虫和成虫的致死率较高、致死时间短,且生长速度快,产孢量大,可作为优良菌株进行下一步实验。

2.3 菌株M14-1、H2不同浓度孢子悬液对松树天牛室内致病力的测定

表4为菌株M14-1、H2对松树天牛成虫致病的死亡率和半致死时间。随着孢子悬液浓度的降低,菌株对松树天牛成虫的半致死时间逐渐增加,死亡率逐渐降低。在孢子浓度为107个·mL-1时,两株菌的致死率均为100%,M14-1的半致死时间为4.15 d,H2的半致死时间为4.31 d。而在孢子浓度为106、105个·mL-1时,松树天牛成虫死亡率皆未达到100%。

表4 两株菌对松树天牛成虫致病的死亡率和半致死时间

在接种5 d时,试虫开始大量死亡,将试虫转移到体视显微镜下观察,可在触角、跗节、口器上观察到少量菌丝,继续保湿培养。死亡2 d时,试虫体表可见大量白色菌丝,主要分布在基节窝、口器以及前胸与中胸之间,菌丝表面已产生少量墨绿色的分生孢子堆;死亡4 d时,试虫体表已布满墨绿色的分生孢子堆,此时试虫触角和足十分脆弱,很容易断裂;死亡6 d时,试虫体表的分生孢子堆更加密集,触角和足变得柔软脆弱(图2)。

A、B为菌株M14-1;C、D为菌株H2。图2 松树天牛成虫感染背面和腹面形态

表5为菌株M14-1、H2不同浓度孢子处理松树天牛后不同时期的累计死亡率,可知孢子悬液浓度越高,累计死亡率就越高,当处理时间为2 d时,在浓度为106、107个·mL-1时已有成虫死亡。当处理时间为8 d时,两株菌在106、105孢子·mL-1浓度处理的天牛累计死亡率均未到达100%,表明仍有少数天牛成虫未感染致死。

表5 菌株M14-1和H2不同浓度孢子处理后的天牛累计校正死亡率

2.4 菌株M14-1和H2的种类鉴定

图3为菌株M14-1、H2培养14 d的菌落形态。菌株M14-1的菌体为圆形,直径约6.10 cm,整体形态为灰色绒毛状,部分呈现为黄色、白色,边缘有一圈轮环,中间突起,菌株H2的菌体为不规则圆形,直径约6.91 cm,整体形态为白色絮状,中部菌丝老化,呈现为浅综色,边缘菌丝表面有一层黑绿色分生孢子堆。两菌株的分生孢子单个存在时均为无色透明、长圆柱形,聚集时为黑绿色,菌株H2的分生孢子颜色略深于菌株M14-1,形态微长于菌株M14-1,菌丝均光滑透明,且分枝分隔,培养基质色泽为淡褐色。

图3 菌株M14-1、H2的形态特征

以ITS1/ITS4为引物,对菌株M14-1、H2的DNA进行PCR扩增,测序结果显示扩增条带长度分别为522、526 bp。使用该序列在国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行局部序列排比检索基本工具(BLAST)比对,并下载相似性高的序列,使用MEGA7.0构建系统发育树(图4)。菌株M14-1与MetarhiziumanisopliaeSC44A03 (MW113483)聚为一支,同源性为99.00%,菌株H2与MetarhiziumanisopliaeBL23 (MW832543)聚为一支,同源性高达99.22%,根据形态学鉴定和系统发育树分析可知,菌株M14-1和H2均属于金龟子绿僵菌(Mertarhiziumanisopliae)。

图4 利用rDNA-ITS序列构建的菌株系统发育树

3 讨论与结论

虫生真菌是一种能够主动侵染害虫,并在害虫体内大量繁殖使其快速病死或衰弱的生防菌[13]。由于虫生真菌的真菌杀虫剂具有防控有效期长、寄主范围广、对非靶标生物无害等优点,因此真菌杀虫剂被广泛应用到农林害虫的防治上[14]。松树天牛在黑龙江省分布广泛且国内针对松树天牛的实际防治策略研究较少。致病力是衡量优良菌株的重要指标,测定不同菌株对害虫的致病力可以筛选出高致病力菌株,菌株的生长特性也是重要的考察指标之一[15]。为了开发针对松树天牛绿色防控方法,本研究将从黑龙江省哈尔滨市、牡丹江市林区土壤样品分离纯化的18株虫生真菌进行筛选。筛选获得的菌株M14-1、H2菌落生长速度快,产孢量大,对松树天牛成虫的致病力均高于其他菌株,在接种的3、6 d累计死亡率均分别达到66%、100%,菌株M14-1、H2对松树天牛幼虫致病力高于其他菌株,在接种的6 d累计死亡率均达到100%,综合考虑其应用于生物防治的潜力较高。通过观察形态和系统发育树分析,鉴定2株菌株均为金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)。

金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae),作为应用广泛的一种昆虫病原真菌,在农林业生产中具有重要的应用价值。目前,绿僵菌的生产、应用和安全性已被许多国家做了大量细致的研究,能够被金龟子绿僵菌寄生的昆虫约有200余种,有些害虫已开发出绿僵菌杀虫剂,且具有良好防治效果[16]。刘建波[17]对星天牛成虫采用爬行法测定了4株金龟子绿僵菌和1株球孢白僵菌的致病力,金龟子绿僵菌MaYTTR-04在15 d内的致死率为100%,半致死时间为9.36 d,僵虫率为40.0%;赵建伟[18]采用浸渍法测定了8株绿僵菌对草地贪夜蛾2年龄幼虫的致病力,在孢子浓度为5×107个·mL-1时,致死率分别为88.76%、82.13%,半致死时间分别为4.81、4.93 d,获得2株高致病力莱氏绿僵菌;何学友[19]采用浸渍法测定了7株金龟子绿僵菌对油茶象幼虫的致病力,结果表明,菌株FJMa201101的半致死时间为1.65 d,感染率为86.60%,FJMa201205的半致死时间为1.71 d,感染率为91.10%。本试验筛选获得的2株菌M14-1、H2在孢子浓度为107个·mL-1时,用浸液法接种松树天牛成虫的半致死时间分别为4.15、4.31 d,其致病性要高于其他供试菌株;刘玉军[20]在筛选高致病力白僵菌时,发现菌株的平均生长速度、产孢量、萌发率均与致病力相关;蔡守平[21]筛选高致病力白僵菌和绿僵菌时,发现菌株产孢量与致病力也具有相关性。而本试验中M14-1、H2的菌落生长速度和产孢量均显著高于其他菌株,表明其应用于生物防治的潜力较高。

本研究虽然通过松树天牛幼虫、成虫进行毒力测定筛选获得了2株高致病力金龟子绿僵菌,但其培养方法、生物特性、林间实际害虫防治效果等尚未明确,今后可继续开展相关研究,为利用金龟子绿僵菌防治松树天牛提供更多支持。