中美欧食品中沙门氏菌检验标准的比较分析

丁卫平 张士财 伊廷存

摘 要：沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌，与食品安全及人类健康息息相关。检验标准是沙门氏菌鉴定的基础与依 据。为给我国现行食品沙门氏菌检验标准的修订提供参考依据，使我国食品中沙门氏菌的检测更加科学准确，本文收集了中 国、美国及欧洲的食品沙门氏菌检验标准，从适用范围、预增菌、选择性增菌、平板分离、鉴定等方面进行了系统比较分析。 结果表明，我國沙门氏菌检验标准与欧洲所使用标准较为相似，与美国所使用标准差别较大，建议在我国食品沙门氏菌检 验标准的制修订过程中，借鉴国外同类型标准先进经验，完善改进我国沙门氏菌检验标准，满足实验室检测需要。

关键词：食品，沙门氏菌，检验，方法，比较

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.03.034

0 引 言

沙门氏菌为革兰氏阴性杆菌，是一种重要的食 源性致病菌[1]，广泛分布于奶和奶制品、肉与肉制 品、蛋及蛋制品等食物中[2-4]。感染沙门氏菌的食品 被人类食用后，可导致肠胃炎、伤寒、副伤寒[5]，呈现 发热、恶心、呕吐、腹泻等症状[6-7]，症状严重的甚至 会使患者死亡。据统计，在世界各国的细菌性食物中毒中，由沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，其中 就包括中国[8]。因此，对食品中是否存在沙门氏菌进 行准确鉴定具有十分重要的意义。对于沙门氏菌的 鉴定，中美欧分别采用了不同的检验标准。中国所采 用的检验标准为GB 4789.4—2016《食品安全国家标 准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》[9]。美国所采 用的的检验标准为美国食品药品监督管理局（FDA） 所制定的细菌分析学手册（Bacteriological Analytical Manual，简称BAM）第八版[10]，其最新版本为2023年 4月份修订版本。欧盟所采取的检验标准为国际标准 化组织（International Organization for Standardization， 简称ISO）制定的ISO 6579-1：2017《食物链微生物 学沙门氏菌检测、计数和血清分型的水平方法第 1部分：沙门氏菌的检测》（Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection， enumeration and serotyping of Salmonella - Part 1： Detection of Salmonella spp.）[11]，ISO 6579-1：2017现行版本为2020 年修订版本，用ISO 6579-1：2017+A1：2020表示。 GB 4789.4—2016从正式实施至今已有7年多的 时间，当前正在开展标准修订前的各项准备工作。 美欧作为发达国家的代表，深入分析沙门氏菌检验 标准，对我国沙门氏菌检验标准的修订具有重要的 意义。本研究针对此问题，对中美欧所使用沙门氏 菌检验标准的相同点与不同点进行了深入比较与分 析，并提出了有针对性的意见建议。

1 三种检验标准的相同之处

中美欧三种检验标准的鉴定步骤都可以分为 四步，即前增菌或称预增菌、选择性增菌、平板分 离、鉴定，虽然三种标准每一步的具体操作有所不 同，但大致都可以分为这四个步骤。

2 三种检验标准的不同之处

对于三种检验标准的不同之处，从以下6个方 面进行逐项分析。

2.1 适用范围

GB 4789.4—2016第一部分范围中规定该标准 适用于食品中沙门氏菌的检验，但由于我国仅对预 包装食品及散装即食食品中的沙门氏菌规定了限 量[12-13]，因此在实际检验中，此标准主要用于预包 装食品及散装即食食品的检验。

ISO 6579-1：2017中规定了该标准的适用范围， 主要包括供人类食用或动物饲养的产品、在食品生 产和处理范围内的环境样品、初级生产阶段的样品 如动物粪便、灰尘和棉签。

FDA细菌分析学手册第8版未明确规定标准的 适用范围，但从该标准的第C部分内容中可以知道 该标准的适用范围不仅包括27类食品及食品添加 剂，还包括食品周边环境及苜蓿、绿豆和西兰花等 作物的发芽灌溉用水。

2.2 预增菌

GB 4789.4—2016预增菌过程为无菌操作称取 25 g或25 mL样品，置入盛有225 mL缓冲蛋白胨水 （BPW）的无菌均质杯或合适容器内均质后，再于 36℃±1℃培养8 h～18 h。

ISO 6579-1：2017规定，最常用的预增菌过程 为称取25 g样品，加入225 mL BPW 10倍稀释均质 后进行培养，培养条件为34℃～38℃培养18 h±2 h。 低于25 g的样品进行检测时按比例加入BPW达10 倍稀释即可，超过25 g的样品及混合样品根据此方 法进行检测时需要分别按照ISO 16140及ISO 6887- 1：2017附录D的规定进行方法验证。靴袜及灰尘的 稀释比例不是10倍，具体要求参照ISO 6887。样品 量大BPW使用量超过1 L时，在与样品混合前，需预 先将BPW加热至34℃～38℃。ISO 6579-1：2017还规 定，预增菌液可在5℃最多保存72 h。

FDA细菌分析学手册第8版中沙门氏菌检测的 预增菌方法是这3种标准中最为复杂的，其应用范 围内的29类产品预增菌方法都不相同，用到的预 增菌液类型多达10种，在预增菌正式培养之前还需要进行各种各样的预处理，伴随着各种添加剂 的适用。进行预增菌时，样品稀释比例通常为25 g （或mL）样品中加入225 mL液体培养基。样品量 低于或高于25 g（或mL）时，根据样品量调整液体 培养基的量，使样品达到10倍稀释。部分样品的 稀释比例非10倍，如香料中的多香果、肉桂和牛至 稀释比例为1：100；丁香稀释比例为1：1000。虽然 不同产品的预增菌方法有所不同，但预增菌的培 养条件基本保持一致，大多要求35℃培养24 h±2 h，少量产品要求35±2℃培养24 h±2 h。值得注 意的是，该方法中还规定，动物性食品预增菌后， 可以直接用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）进行筛查， 仅LAMP筛查结果为阳性的需要对其预增菌液进 行进一步检测。

2.3 选择性增菌

GB 4789.4—2016规定的选择性增菌过程为 移取1 mL预增菌液，转种于10 mL 四硫磺酸钠煌绿 （TTB）内，于42℃±1℃培养18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于10 mL 亚硒酸盐胱氨酸（SC）内，于 36℃±1℃培养18 h～24 h。

ISO 6579—1：2017规定，对于食品、动物饲料 样品、食品生产区域环境样品，其选择性增菌过 程为取预增菌液0.1mL转种到含10mL Rappaport[1]Vassiliadis Enrichment Broth（RVS）肉汤的试管中或 Modified Semi-Solid Rappaport-Vassiliadis（MSRV） 琼脂平板表面（等距接种1至3个点），于41.5℃培 养24h±3h。同时取预增菌液1mL转移到Muller[1]Kauffmann Tetrathionate- novobiocin（MKTTn）肉汤 中，于34℃～38℃之间培养24 h±3 h。在干奶制品或 奶酪中，沙门氏菌可能会受到致命的伤害，检测这些 产品时，选择性培养基需要额外培养24 h±3 h。还 有一点需要注意的是，MSRV琼脂用于检测具有动力 的沙门氏菌，不适用于无动力沙门氏菌株。初级生 产阶段样品的选择性增菌需要取0.1 mL预增菌液转 移到MRSV琼脂平板进行培养，培养条件为41.5℃培 养24 h±3 h，标准中还说明如果使用第2种选择性培 养基比如MKTTn培养24 h检测灵敏度能得以改善。

FDA细菌分析学手册第8版中规定，对于瓜尔 豆胶和怀疑受鼠伤寒沙门氏菌污染的食品，其选择 性增菌过程为分别取1毫升预增菌液转种至10 mL SC和10 mL TTB培养基，并在35℃培养24 h±2 h。 其他所有食品的预增菌过程则为，将0.1 mL预增菌 液转种至10 mL Rappaport-Vassiliadis（RV）培养基， 于42℃±0.2℃条件下培养24 h±2 h；同时另取1 mL 预增菌液转种至10 mL TTB培养基，这些食品中微 生物负荷量高的食物，转种至TTB培养基后需要在 43℃±0.2℃条件下培养24 h±2 h，微生物负荷量低 的食物转种至TTB培养基后则需要在35℃±2.0℃条 件下培养24 h±2 h。

2.4 平板分离

GB 4789.4—2016规定，取培养后的TTB及SC选 择性增菌液，分别划线接种于亚硫酸铋（BS）琼脂 平板和木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂平板（或 Hektoen Enteric（HE）琼脂平板或沙门氏菌属显色培 养基平板），其中BS 琼脂平板需要在36℃±1℃培养 40 h～48 h，XLD 琼脂平板、HE 琼脂平板、沙门氏菌 属显色培养基平板需要在36℃±1℃培养18 h～24 h。

ISO 6579-1：2017规定，对于食品、动物饲料样 品、食品生产区域环境样品，其分离步骤为，用接种 环从RVS增菌液或MSRV琼脂平板及MKTTn增菌液 中蘸取一环后，接种至XLD平板及另外一种选择性 平板中，另外一种选择性平板要与XLD琼脂平板互 补且与XLD判别原理不同。XLD平板的培养条件为 34℃～38℃培养24 h±3 h。对于初级生产阶段的样 品，则用接种环取MSRV琼脂平板上的菌落接种至 XLD平板及第二种选择性平板。XLD平板的培养条 件也为34℃～38℃培养24 h±3 h。初级生产阶段的 样品在MSRV琼脂平板初次培养未生长菌落时，需 要再额外培养24 h±3 h。

FDA细菌分析学手册第8版中规定，TTB与RV/SC 培养基中培养的增菌液都需要分别划线接种到BS、XLD、HE三种琼脂平板上后于35℃培养24 h±2 h。

2.5 鉴定

GB 4789.4—2016中规定，对于选择性琼脂平 板上生长的典型和可疑菌落，需要进行生化鉴定及 血清学鉴定，可以自主选做血清学分型。做生化鉴 定时，既可以根据标准中规定的方法逐步开展，也 可以根据三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验结果选 择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统 进行鉴定。血清学鉴定时，要先检查培养物有无自 凝性，再对无自凝现象的培养物进行多价菌体抗原 及多价鞭毛抗原鉴定。

与GB 4789.4—2016中的规定相似，ISO 6579- 1：2017中也规定，对于选择性琼脂平板上生长的典 型和可疑菌落，需要进行生化鉴定及血清学鉴定， 可以自主选做血清学分型。进行生化鉴定时既可以 按照ISO 6579-1：2017规定的方法进行，也可以使用 经验证的商业化的培养基或生化鉴定试剂盒。ISO 6579-1：2017规定的生化鉴定方法及判定方法较为 简单，三糖铁琼脂试验、尿素琼脂试验、赖氨酸脱 羧酶试验属于必做项目，如果这三项试验无法给 出明确的鉴定结果，可以再做另外两项生化试验。 ISO 6579-1：2017还规定，进行血清学鉴定时，要 先排除能够引发自凝现象的菌株，再进行多价O抗 原、Vi抗原及多价H抗原鉴定，其中Vi抗原鉴定属 于选做项目。

FDA细菌分析学手册第8版中规定，与对照菌 株培养产物进行比对后，对于BS、XLD、HE三种琼 脂平板上生长的可疑性菌落，要先进行三糖铁琼脂 试验及赖氨酸脱羧酶试验，对于这两种试验中被 推定为沙门氏菌的培养物再进行进一步生化鉴定 及血清学鉴定。此方法中生化鉴定方法比较繁琐， 不再详述。此标准中血清学鉴定方法主要包括三 种，即多价鞭毛血清学试验、Spicer-Edwards血清学 试验及血清學体细胞（O）试验。初步生化试验结 果及血清学试验结果中未表现出典型沙门氏菌反 应的菌落需要进一步用补充生化实验进行鉴定。值 得注意的是，在本方法中还指出，以下几种方法是 公认的通用的沙门氏菌的鉴定方法，包括上述三种 血清学试验方法、5种商业生化系统鉴定方法、实 时定量PCR方法、LAMP方法、ANSR 沙门氏菌确 定方法、布鲁克飞行时间质谱生物分型法。在本方 法中还规定，通过生化试验、血清学试验方法鉴定 出沙门氏菌后，可送往特定实验室通过全基因组测 序、seqsero数据库比对分析或传统血清学分型方法 进行血清分型。

2.6 修订次数

GB 4789.4—2016自2017年6月23日实施以来， 尚未进行过修订。ISO 6579-1：2017自2017年实施以 来，于2020年修订过一次。FDA细菌分析学手册第8 版自2000年11月14日正式定稿以来，到目前为止，已 经进行了28次修订。

3 结 论

从中美欧三种沙门氏菌检验标准的分析中可 以看出，GB 4789.4—2016与ISO 6579-1：2017两个 标准有诸多的相似之处，与FDA细菌分析学手册 第8版的差异较大。这三种标准中，FDA细菌分析 学手册第8版沙门氏菌的检验方法令人感触颇深， 具有3个极为明显的特点。第一个特点是方法规定 最为细致，根据不同食品样本的特点制定了不同的 前增菌方法，这样可以最大程度地使样品中的目标 菌得以增殖，提高预增菌效率，减少漏检；第二个 特点是对新技术的应用最多，广泛地将现代科学 技术的最新成果应用于沙门氏菌的鉴定，明确了全 自动生化鉴定系统、实时定量PCR方法、LAMP方 法、ANSR 沙门氏菌确定方法、飞行时间质谱生物 分型法、全基因组测序等新型鉴定技术在沙门氏菌 鉴定中的作用；第三个特点是更新速度快，自2000 年11月14日正式定稿以来，到目前为止已经进行了 28次修订。

GB 4789.4是国家基础标准，使用者众多，影响范围广，在国家标准体系中有着非常重要的地位。

标准制定机构应及时对标准进行修订，使标准符合 用户需求与时代发展。在标准的修订过程中，建议 从以下三个方面努力，做好修订工作。一是要加强 研究，完善标准细节。要对方法中涉及的培养基、 培养条件、试剂等开展详细科学的研究，确定最优 条件。二是要加大现代科学技术的应用力度。近年 来，迅速发展的分子生物学技术在微生物检测方面 具有鉴定速度快、准确率高的特点，应加大这些新 技术的运用力度。三是要加快标准修订速度。应创 新体制机制，改善标准修订流程，缩短标准修订时 间。

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作者简介

丁卫平，高级工程师，分子生物测定室主任，研究方向为食 品检验检测。

张士财，工程师，食品检验员，研究方向为食品检验检测。

（责任编辑：袁文静）