宏基因组二代测序技术在血液病患者合并感染诊疗中的应用

封 韬,付 堃,张智慧,芦小单,高 鹏

(1.吉林省人民医院血液科,吉林 长春 130021;2.吉林省人民医院精准分子医学中心,吉林 长春 130021)

血液病尤其是恶性血液病患者,由于肿瘤细胞恶性克隆性增生、骨髓正常造血功能被抑制、免疫细胞功能受抑等原因,病程中常伴随感染、出血、肺部弥漫性损伤及多器官功能障碍等严重并发症。其中感染是导致病情加重甚至死亡的主要原因之一[1]。此外,患者接受化疗、使用糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗措施,可导致病人黏膜免疫屏障受损,免疫细胞功能受抑进一步加剧,因此恶性血液病患者的感染发病率较高,甚至导致死亡。血液病合并感染可发生于任何组织器官,以肺部、血液、口腔及肛周最为常见,主要病原微生物包括细菌、真菌及病毒等。病原微生物通过各种途径进入血液循环,可导致血流感染,甚至可引起感染性休克、弥散性血管内凝血、多脏器功能衰竭乃至死亡[2]。

宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是精确诊断感染的关键驱动力,可一次性对数百万甚至千万个DNA序列进行测序,对DNA的序列分子进行读取,获得丰富的遗传学信息的同时,还可大大降低测序费用、缩短测序时间,一次检测大量靶基因[3]。此外,mNGS涵盖耐药基因检测,可以在检出病原体的同时提示其可能存在的耐药性,指导临床合理选择敏感抗生素[4]。本研究对血液病合并感染患者的传统病原体检测结果和mNGS检测结果进行比较,探讨mNGS检测对血液病合并感染在诊疗及临床用药等方面的优势及临床应用价值,为血液病患者感染类疾病的诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年8月至2022年12月吉林省人民医院血液科血液病合并感染患者作为研究对象,根据研究需要纳入患者20例,纳入标准为:(1)依据MICM分型、病理学等实验室检查,明确诊断为血液系统疾病的患者,肿瘤性疾病优先;(2)住院期间出现持续或间断发热、临床诊断为病原微生物感染、常规实验室检测病原菌并给予经验性抗生素治疗后疗效欠佳者,送检标本行mNGS检测。排除标准为:(1)未明确诊断血液恶性肿瘤或伴有其他恶性肿瘤疾病患者;(2)生命体征不稳定或心肺功能不全的患者;(3)无常规实验室病原体检测结果的患者。

1.2 方法

宏基因组测序:(1)总DNA提取及DNA文库构建:应用自动化提取建库仪制备文库,采用荧光定量PCR进行文库定量;(2)上机测序:应用NextSeq CN500测序仪(美国Illumina公司)对构建好的DNA文库进行测序;(3)生物信息学分析:对读取的文库序列数据进行生物信息学分析,过滤其中的人类基因组序列数据,将其余序列数据与微生物参考数据库进行比对,从而确定病原体物种及其相对丰度。

1.3 统计学处理

应用SPSS 25.0统计软件进行数据分析,单因素分析采用卡方检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 研究结果

2.1 临床特征

共纳入患者20例,其中男性8例,女性12例,中位年龄为53.5岁。血液病类型包括:骨髓增生异常综合征1例,急性髓系白血病6例,急性淋巴细胞白血病2例,再生障碍性贫血3例,淋巴瘤2例,免疫性血小板减少症1例,骨髓纤维化2例,自身免疫性溶血性贫血1例,不明原因贫血2例。标本送检前所有患者均出现不同程度发热、血常规及其他感染指标异常、怀疑严重感染且经验性抗感染治疗效果不佳等状况。

2.2 mNGS与常规检测方法结果的比较及治疗转归

在20例出现感染的患者中,16例(80%)患者的mNGS结果呈阳性,4例(20%)呈阴性;3例(15%)患者的传统检测结果呈阳性,17例(85%)患者检测结果呈阴性,说明mNGS阳性检出率大于传统检测结果(P<0.05)。其中3例mNGS结果与传统检测结果均为阳性,13例仅mNGS结果呈阳性,4例mNGS结果与传统检测结果均为阴性,两种检测方法的一致性较差(P>0.05)。

患者入院时,依据病史、临床表征以及常规检测结果,临床给予基础经验性抗感染治疗。mNGS检测结果回报后,临床依据检测结果调整用药方案,最终12名患者明显好转,8名患者死亡。回溯分析发现,在感染早期进行mNGS的检测,对改善患者预后、提高生存率具有重要意义。

2.3 mNGS 与常规检测方法结果的病原体分布比较

在20例患者中,mNGS直接检出病原菌16例,未检出4例,其中单纯细菌感染3例(18.8%)、单纯真菌感染1例(6.2%)、单纯病毒感染4例(25%)、两种以上感染8例(50%)。mNGS检测出病原菌的16例中,检出细菌12种、真菌8种、病毒7种。通过传统检测血培养检出病原菌3例, 未检出17例,其中细菌3种、真菌1种、病毒0种,两种检测方法的病原体检出结果见表1。

表1 两种检测方法检出病原菌种例数

检出率最高的为细菌类(44.5%),其次为真菌类(29.6%),检出率最低的是病毒类(25.9%),细菌类铜绿假单胞菌的检出率较高,其他菌株种类较分散;真菌类烟曲霉检出率较高,其次为黄曲霉和白色念珠菌、耶氏肺孢子菌;病毒中以人疱疹病毒4型、人疱疹病毒5型最常见。

2.4 不同样本的mNGS检测结果阳性率比较

采用mNGS检测肺泡灌洗液、痰液、组织的阳性率为100%,而血样本的阳性率为55%,相较于肺泡灌洗液、痰液、组织等局部标本的检出率明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。表明相较于血液样本,肺泡灌洗液、房水、痰液等采集于局部病灶的样本检出率更高、检测效果更好。

2.5 mNGS检测结果中耐药基因的分布

mNGS检测在检测样本中是否含有致病菌的同时,还可对患者是否存在耐药基因进行检测。20例患者中,2例检测出耐药基因,1例对大环内酯类、林可酰胺类、链阳霉素以及头孢霉素抗生素耐药,1例对肽类、氟喹诺酮类、利福霉素、四环素类、大环内酯类、林可酰胺类、链阳霉素、头孢霉素、碳青霉烯类、青霉烷类、砜类以及磺胺类耐药。相较于传统检测方法,mNGS可全面检出患者存在的耐药基因,可及时、准确地给予临床用药指导,对患者的治疗具有重要价值。

3 讨论

血液病患者由于其疾病的自身特点,以及治疗过程中使用大量的激素、免疫抑制剂及化疗药物等,易造成黏膜屏障破坏,免疫功能损伤继而引发感染等并发症,感染是造成患者治疗失败甚至死亡的主要原因之一[5]。然而血液病患者的感染常伴有病原菌检出率低、病情进展快、临床经验性治疗效果欠佳等问题,因而在感染早期快速、准确地检出致病菌,在早期给予干预,对患者的治疗及预后具有重大意义。

细菌培养是病原体检测的传统方法,用于培养的样本包括外周血、痰液、体液等,然而细菌培养的灵敏度较低,且受技术影响部分病原菌培养困难,限制了其在精确诊疗中的广泛应用。研究发现,AHO患者外周血的细菌培养敏感性不足50%[6]。而mNGS作为高通量测序技术,被认为在病原体检测中发挥重要作用[7]。相比于传统病原体检测方法,mNGS的灵敏度高,在细菌病毒等载量较低时,即可精确诊断,指导临床在感染早期予以控制,疗效显著。ZHANG等[8]研究发现,mNGS可精准诊断细菌培养尚为阴性的隐球菌感染所致骨髓炎。CHEN等[9]研究表明,针对外周血的mNGS检测可早期诊断重症肺炎患者的血流感染。

本研究将传统病原体检测方法和mNGS检测进行对比,结果显示mNGS在检出率(80%)以及检出病原菌的丰富度方面均优于传统检测方法。此外,20例患者样本中血液样本的检出率为55%,显著低于局部病灶的样本检出率(100%)。针对感染传统的检测手段主要是血培养、痰培养,然而20例样本中17例样本的血、痰培养为阴性,显著低于mNGS的检出率,血培养敏感度低,在感染早期易造成漏诊,可能延误病情,对患者的治疗及预后不利。此外,结果表明,在出现感染的患者中,多为细菌、真菌及病毒两种或两种以上混合型感染,给临床的诊疗及用药带来了巨大的阻力。同时,真菌及病毒培养困难,因此传统的细菌培养难以检出或仅检出部分病原体,而mNGS检测具有准确度高、覆盖面广等优点,对临床进一步优化用药方案、提高患者整体预后具有重要意义。

通过与传统病原体检测手段作比较,证实了mNGS具有覆盖面广、灵敏度高等优点,对临床诊疗具有重要指导意义,但本研究样本数量有限,得出的结论仅为mNGS的研究提供部分理论基础,未来将继续深入研究mNGS在病原体筛查诊断中的作用。目前mNGS技术尚处于快速发展阶段,在药敏和毒力基因检测等方面仍存在局限性[10],因此尚不能作为临床诊疗的独立依据,应结合临床表征进行甄别、诊断。随着技术的飞速发展、临床经验的不断积累,未来mNGS将广泛应用于临床诊疗,以综合判定病情,及时为患者提供个体化治疗方案。