抗肿瘤药物对慢性放射性肠损伤影响的病理学研究

任正婷 桂仲璇 蒋 俊 汪 浩 张佐阳

放射性肠损伤是宫颈癌放射治疗常见的并发症，尽管目前使用精准放疗技术成功地减少了对直肠等肠道危及器官的照射，但仍多达20%的宫颈癌患者会出现辐射后肠损伤的症状［1-2］。宫颈癌的治疗多为综合治疗，包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等［3］。值得注意的是，部分药物也会对肠道黏膜细胞造成一定程度的损伤［4-5］。既往临床前瞻性研究指出，加用紫杉类药物同步放化疗治疗宫颈癌患者会增加腹泻发生率［6］。而抗血管生成药物治疗宫颈癌患者可导致胃肠瘘和肠穿孔发病率升高［7］。慢性放射性肠损伤的主要病理特征是闭塞性血管内膜炎和间质纤维化，导致进行性肠壁缺血［8］。然而目前尚无来自临床的标本验证这两类药物对慢性放射性肠损伤组织的作用。因此本研究旨在从病理学角度探讨紫杉类药物和抗血管生成药物对宫颈癌慢性放射性肠损伤的影响，进一步明确宫颈癌慢性放射性肠损伤患者发生严重并发症的独立危险因素，以期为个体化诊疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年8月至2023年4月期间于安徽医科大学第一附属医院病理诊断明确的宫颈癌慢性放射性肠损伤患者49例，年龄40～83 岁，平均（57.2±11.0）岁。49例宫颈癌患者依据国际妇产科联盟（international federation of gynecology and obstetrics，FIGO）分期［9］为ⅠB～ⅣA 期，均采用盆腔外放射治疗（external radiation therapy，EBRT）+高剂量率腔内照射（high dose rate intracavitary therapy，HDRICR）联合治疗。EBRT：42～51Gy/23～28F，阳性淋巴结同步加量至56～62 Gy，5 F/W；HDRICR 采用192Ir 放射源治疗，18～30 Gy/3～5 F，1～2 F/W。其中36例患者EBRT采用调强放射治疗，10例患者采用三维适形放射治疗，3例患者采用二维放射治疗。根据药物治疗方案不同分为抗血管生成药物治疗组12例和无抗血管生成药物治疗组37例；紫杉类药物化疗组23例和无紫杉类药物化疗组26例。

1.2 方法

1.2.1 临床特征 根据Herrmann 提出的肿瘤放射治疗协作组（radiation therapy oncology group，RTOG）/欧洲癌症研究和治疗组织（European organisation for research and treatment of cancer，EORTC）评分标准对49例患者的慢性放射性肠损伤临床症状进行分级［10］，3 级和4 级患者纳入严重并发症组。严重并发症组29例患者中15例行外科手术治疗。进一步根据患者年龄、宫颈癌分期、宫颈病灶大小、化疗方案，是否抗血管生成药物治疗、放疗总剂量和直肠V20 受量对严重并发症组与无严重并发症组患者的基线资料进行临床特征匹配。见表1。

表1 宫颈癌慢性放射性肠损伤有无严重并发症患者的临床特征比较

1.2.2 HE 染色 49例患者标本均经10% 中性缓冲福尔马林固定，常规脱水石蜡包埋，3 μm 连续切片，行HE 染色，于光学显微镜下对结直肠病理学变化按照直肠放射性病理损伤半定量评分系统进行评分［11］，选定评估肠道损伤的5 个指标：黏膜损伤、炎症细胞浸润、肠管纤维化、水肿和血管狭窄（见图1）。见表2。

图1 HE染色显示狭窄血管

表2 放射性病理损伤半定量评分表[11]

1.2.3 免疫组化染色（EnVision两步法） 石蜡切片常规脱蜡至水后EDTA 高温高压抗原修复，切片浸泡在3% H2O2中10 min 以清除内源性过氧化物酶活性，PBS浸泡3 次、每次5 min，PBST 冲洗1 次、5 min，一抗 （包括：单克隆小鼠抗人VEGFA 抗体19003-1-AP 稀释比1∶50，购于ProteinTech Group 公司，单克隆小鼠抗人CD31 抗体MAB-0720，稀释比1∶50，购买于北京中杉金桥生物技术有限公司）4 ℃冰箱中孵育过夜，复温20 min，PBS 重复浸泡，二抗（山羊抗小鼠/兔二抗PV6000购买于北京中杉金桥生物技术有限公司）室温孵育15 min，经DAB 显色，苏木素复染。以PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 Masson 染色 Masson 三色染色液（BA4079B）购买于珠海贝索生物技术有限公司，按照试剂盒说明书使用。3 μm 厚度石蜡切片常规脱蜡至水，取出Weigert 铁苏木素A 液、B 液，1∶1 均匀混合后使用，将组织完全覆盖5 min，蒸馏水冲洗反蓝，经丽春红酸性品红溶液染色后蒸馏水冲洗3 min，磷钼酸溶液染色后经苯胺蓝溶液染色5 min，随后浸泡在0.2%乙酸溶液中，常规脱水透明，中性树脂封片。

1.3 观察指标

1.3.1 放射性损伤程度评估 2 位评估者（中级及以上医师职称）进行盲法评估，评估者不清楚病理标本上患者的临床信息。先于10 倍物镜下观察标本整体情况，再利用多头显微镜进行同时评分，指标一致后记录评分。病理总分为溃疡、炎症、水肿、坏死和纤维化的评分之和。

1.3.2 VEGF 和CD31 阳性判断 细胞质染色主要呈棕黄色或棕褐色判定血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达阳性；血管内皮细胞的胞质中出现棕褐色颗粒或棕黄色为染色阳性，判定为CD31 阳性（见图2）。

图2 免疫组化CD31示狭窄血管内皮细胞

1.3.3 血管狭窄程度评估 2 位评估者（中级及以上医师职称）进行盲法评估，先于10 倍目镜下观察标本整体情况，沿黏膜肌层开始划到黏膜下层和肌层连接区域，于200 倍物镜下计数总面积0.55 mm2黏膜下层CD31 阳性血管数，计数直径＞35 μm 的血管并测量血管狭窄程度。微血管计数为总血管数减去大血管数。血管狭窄比例为所有分级的狭窄血管数占总血管数的比例。

1.3.4 纤维化程度评估 胶原纤维呈天蓝色至亮蓝色，肌纤维、胞质、纤维素、角质呈红色至紫红色，红细胞呈水红色。

1.4 统计学方法 采用SPSS 27.0 进行统计分析。偏态分布计量资料用M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料用频数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。单因素和多因素分析采用Cox 统计学方法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗血管生成药物对慢性放射性肠损伤影响的病理学分析 抗血管生成药物治疗组的狭窄血管计数、狭窄血管比例、溃疡和炎症程度分均高于无抗血管生成药物治疗组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而抗血管生成药物治疗组的微血管计数和纤维化程度均低于无抗血管生成药物治疗组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 抗血管生成药物对慢性放射性肠损伤影响的病理学分析[M(P25，P75)]

2.2 紫杉类药物对慢性放射性肠损伤影响的病理学分析 紫杉类药物化疗组与无紫杉类药物化疗组间各项病理指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 紫杉类药物对慢性放射性肠损伤影响的病理学分析[M(P25，P75)]

2.3 慢性放射性肠损伤有无严重并发症的病理学分析 严重并发症组的狭窄血管比例和溃疡程度均高于无严重并发症组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。严重并发症组与无严重并发症组间微血管计数、狭窄血管计数、病理总分、炎症、水肿、坏死和纤维化指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 慢性放射性肠损伤有无严重并发症的病理学分析[M(P25，P75)]

2.4 慢性放射性肠损伤严重并发症危险因素Cox 分析 把年龄、宫颈癌分期、宫颈病灶大小、化疗方案、是否抗血管生成药物治疗、放疗总剂量和直肠V60 受量这些临床特征纳入Cox 单因素分析，结果显示宫颈癌分期、直肠V60≥20%和抗血管生成药物是影响慢性放射性肠损伤严重并发症的因素（P均＜0.05）。将这些因素进一步纳入Cox 多因素分析，结果表明宫颈癌分期和直肠V60≥20% 是慢性放射性肠损伤患者发生严重并发症的独立危险因素（P均＜0.05），而抗血管生成药物不是慢性放射性肠损伤患者发生严重并发症的独立危险因素（P＞0.05）。见表6。

2.5 慢性放射性肠损伤不同发生时间的病理学分析49例患者慢性放射性肠损伤发生的中位时间为9 个月，平均（24.0±47.4）月。放疗后＜1年发生组的狭窄血管比例、病理总分、溃疡和炎症程度均高于放疗后≥1年发生组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而放疗后＜1年发生组的微血管计数和纤维化程度（见图3）均低于放疗后≥1年发生组（见图4），差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表7。

图3 Masson染色示黏膜层内纤维化轻微

图4 Masson染色示黏膜层内纤维化（蓝色）显著

表7 慢性放射性肠损伤不同发生时间的病理学分析[M(P25，P75)]

3 讨论

放射性肠损伤根据发生时间，以3 个月为界限分为急性和慢性两种类型。部分患者的急性放射性肠损伤症状在3 个月内会自行缓解，但有些患者可能发展成持续超过3 个月以上的慢性放射性肠损伤［8］。慢性放射性肠损伤的严重并发症包括直肠大出血、肠梗阻和瘘管形成等，对患者的身体健康和生活质量产生严重影响。目前尚无特效的治疗手段，部分患者甚至需要手术干预，临床诊治难度较大［11］。慢性放射性肠损伤通常在8～12 个月内发生，但放射诱导的直肠病可在放疗后30年出现［12］。笔者的研究结果显示，患者发生慢性放射性肠损伤的中位时间为9 个月，其中两位患者分别在放疗后19年和20年出现放射性肠损伤症状。与放射性肠损伤相关的危险因素较多，其中主要的危险因素是直肠受照射剂量体积，例如V60。此外，合并疾病如糖尿病和高血压也会增加患者发生慢性放射性肠损伤的风险［13］。抗肿瘤药物和放射治疗的联合使用亦可能会加重肠道损伤，从而导致严重并发症。因此，研究紫杉类药物和抗血管生成药物对慢性放射性肠损伤的影响，对临床上宫颈癌并发慢性放射性肠损伤患者后续药物治疗方案的选择具有重要意义。

慢性放射性肠损伤是一个复杂的病理过程，其中微血管损伤和异常血管生成被认为是其进展的重要原因［14］。然而，在放射性肠损伤的发生和发展过程中，血管生成是过度还是抑制存在争议。Wu 等［15］的研究结果显示，在慢性放射性肠损伤中，黏膜层和黏膜下层的血管抑素表达明显增加，提示血管生成受损。笔者的研究结果表明，在放疗后1年以上出现肠损伤患者的微血管计数高于放疗后1年内出现肠损伤的患者，但其血管狭窄比例低于放疗后1年内出现肠损伤的患者。这些结果提示，早期辐射诱导的炎症和氧化应激可能导致微血管受损和狭窄。但在炎症缓解后会出现新生的代偿微血管。这些发现进一步支持了炎症和血管化之间的病理联系［16］。然而，其中的机制非常复杂，包括肠道菌群失调和代谢物增加后引发炎症因子释放，以及通过调控一系列免疫效应分子表达来动态影响辐射诱导的肠道损伤［17-18］。

既往研究已经表明，在化疗性肠炎的组织病理中可以观察到肠道微血栓形成［19］。此外，抗血管生成药物也已被发现能引起血栓性微血管病变［20］。笔者的研究发现，接受抗血管生成药物治疗的患者血管狭窄比例高于未接受该治疗的患者，但其微血管计数明显低于未接受抗血管生成药物治疗的患者。这提示抗血管生成药物在抑制血管生成的同时可能增加血管损伤。由于血管完整性受损，底层胶质和胶原蛋白被暴露，导致出血或血栓形成，并进一步刺激炎症反应［16］。这与笔者研究中发现的抗血管生成药物治疗组患者更明显的溃疡和炎症相符。这些变化可能同时参与放射性肠损伤闭塞性血管病变的发展过程。目前，抗血管生成药物主要用于癌症治疗，并且已经在溃疡型结肠炎（ulcerative colitis，UC）模型［21］和炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者［22］中进行了研究，结果显示抗血管生成药物可能是UC 和IBD 的新治疗选择。有报道证实，贝伐珠单抗治疗遗传性出血性毛细血管扩张症患者的慢性出血和贫血安全有效［23-24］。因此，可以推测抗血管生成药物可能对减少出血并发症有效。另外，一项荟萃分析结果显示，贝伐珠单抗的出血风险与剂量和应用时间相关［25］。这个发现给予新的启示，可以在剂量和时间窗口上进一步探索。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为一个关键的促血管生成因子，在平滑肌细胞和成纤维细胞中也有表达［26］，并在特发性肺纤维化的发病机制中起着重要作用。目前已经有研究报道，抗VEGF 是特发性肺纤维化的广谱治疗选择之一［27］。放射性纤维化主要由于上皮和内皮细胞损伤导致异常血管结构重建，以及成纤维细胞或肌成纤维细胞群体的扩张和激活，进而导致细胞外基质的异常积累和结构畸变［28］。笔者的研究结果显示，接受抗血管生成药物治疗的患者纤维化程度轻于未接受抗血管生成药物治疗的患者，这是否与VEGF 存在相关性尚需进一步研究。

然而，紫杉类药物化疗组与无紫杉类药物化疗组之间，在慢性放射性肠损伤患者的病理指标统计结果方面，并未观察到紫杉类药物对肠道组织的明显影响。此外，通过分析发现，慢性放射性肠损伤严重并发症组的狭窄血管比例和溃疡程度高于无严重并发症组，这与接受抗血管生成药物治疗患者的病理特点部分一致。进一步的Cox 单因素分析结果显示，宫颈癌分期［29］、直肠V60≥20%［30］和接受抗血管生成药物治疗是影响严重并发症发生的因素。然而，多因素分析表明，抗血管生成药物并非慢性放射性肠损伤患者发生严重并发症的独立危险因素。这可能与该研究为回顾性研究、患者之间均衡性不佳以及样本量有限有关。

综上，紫杉类药物对宫颈癌慢性放射性肠损伤组织没有明显的影响。抗血管生成药物可加重宫颈癌慢性放射性肠损伤组织的血管狭窄、溃疡和炎症，但减轻了纤维化。具体的机制需要进一步探索。关于抗血管生成药物在慢性放射性肠损伤严重并发症危险因素的单因素和多因素分析结果不一致，提示该研究存在一定的局限性。因此需要更大样本量的前瞻性临床研究进一步验证。