硝基呋喃抗菌骨水泥的动物体内生物相容性研究

郭 锐 阚宇辰 高 喆 韩庐阳 卜文翰 许 杨 储建军

抗生素骨水泥（antibiotic-loaded bone cement，ALBC）的爆发性释放会导致抗菌时间缩短［1］。释放一周后局部抗生素浓度低于最低抑菌浓度，易导致细菌耐药性的产生。而非浸出抗菌骨水泥（non-leaching bone cement， NLBC）中的抗菌基团不会洗脱，抗菌基团可破坏粘附在骨水泥表面细菌的细胞膜，达到抑制或杀灭细菌的效果，这种非浸出的接触抗菌机制可以大幅延长抗菌时间［2-3］。目前研究较多的是含杂环化合物的NLBC 以及含季铵盐类化合物的NLBC 等［4-5］。近期报道的含硝基呋喃非浸出抗菌骨水泥p（NFMA-co-MMA）具有良好的表面抑菌性能和体外细胞相容性［6-8］。本研究使用动物模型研究硝基呋喃非浸出骨水泥的体内生物相容性，进一步深入了解这种非浸出骨水泥的生物相容性能，旨在为硝基呋喃抗菌骨水泥临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 原材料 商业骨水泥包含由PMMA（14.84 g）、过氧化苯甲酰（0.16 g）、硫酸钡（10 g）组成的固相（25 g）和由MMA（9.93 mL）、N，N-二甲基对甲苯胺（0.07 mL）、对苯二酚（10-20 ppm）组成的液相（10 mL），购自法国赛尼迈德公司。p（10% NFMA-co-MMA）通过文献报道的方法制备［7］。C57 小鼠、新西兰兔购自安徽医科大学实验动物中心。

1.2 PMMA 骨水泥和p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥的制备 固相和液相按2∶1 的比例配置。用模具制作不同尺寸样件，分别为长（12.0±0.1） mm，直径（6.0±0.1） mm 以及长（6.0±0.1） mm，直径（6.0±0.1） mm 的圆柱体。

1.3 浸提液的制备 样件（长12.0 mm，直径6.0 mm）在37℃的生理盐水（0.9% 氯化钠溶液，添加量为0.2 g/mL）中静置72 h。得到的浸提液继续用0.9%氯化钠稀释至指定浓度，分别为40%、80% 和100%。不同浓度的浸提液经121 ℃下高压灭菌20 min 后储存于4 ℃冰箱中待用［9］。

1.4 急性全身毒性实验 将21 只C57 小鼠（体质量16～21 g）采用完全随机分组方法分为7 组，每组3 只。Ⅰ：空白对照组（0.9%氯化钠溶液）；Ⅱ：40% PMMA 浸提液组；Ⅲ：80% PMMA 浸提液组；Ⅳ：100% PMMA 浸提液组；Ⅴ：40% p（10% NFMA-co-MMA）浸提液组；Ⅵ：80% p（10% NFMA-co-MMA）浸提液组；Ⅶ：100% p（10% NFMA-co-MMA）浸提液组。每组采用相同的方法进行腹腔注射（注射部位为小鼠下腹部距腹白线0.5 cm 处，针头与皮肤表面呈30°刺入小鼠腹腔并注射浸提液）。各组注射量均为50 mL/kg。所有实验小鼠均于安徽医科大学实验动物房，在18～22 ℃通风干燥环境下，给予鼠粮就和充足水源分笼饲养。于注射后24 h、48 h 和72 h 观察小鼠一般状态（如呼吸、运动和食欲等情况）、体质量变化和毒性反应（如腹泻、呕吐、惊厥等情况）。72 h 后统一处死小鼠，取肝脏和肾脏进行组织学观察（苏木精-伊红染色）。按照GB/T 16886［10］评价急性全身毒性。

1.5 肌肉植入实验 选取6 只新西兰兔（体质量2～3 kg），在全身麻醉下（速眠新与舒泰混合体积比为2∶1，按0.1 mL/kg 剂量进行耳缘静脉注射麻醉）通过直接手术将预处理的PMMA 和p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥样件植入兔的棘旁肌肉组织中。本研究中使用的骨水泥样件为圆柱体（长6.0 mm，直径6.0 mm）。在兔脊柱两侧约2 cm 的对称位置处选择两个植入部位，一侧植入PMMA 样件，另一侧植入p（10% NFMA-co-MMA）样件，上下间距约2.5 cm。切开皮肤筋膜，沿长轴钝性分离肌肉组织，形成肌腔，分别植入实验材料，每侧植入2 个样件，然后逐层缝合组织，切口予铝喷覆盖保护，连续3 日肌肉注射头孢呋辛，预防感染。所有实验兔均于安徽医科大学实验动物房，在通风干燥环境下，给予兔粮、蔬菜及充足水源分笼喂养。术后所有实验兔子均正常苏醒，进食与活动情况正常，术后切口均未发生感染。分别在第2 周和第4 周各处死3 只新西兰兔，取样件周围0.5～1 cm 的肌肉组织。将肌肉组织切片，用苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察骨水泥植入后局部组织炎症反应情况。按照GB/T 16886［10］评价肌肉组织对植入材料的生物学反应。

1.6 统计学方法 采用SPSS 22.0 进行数据统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；两组不同时间点均数的比较采用重复测量方差分析；计数资料以百分比表示，组间比较采用χ²检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性全身毒性实验

图1 兔背部肌肉植入术

2.1.1 一般情况及体质量变化 在注射不同浓度的p（10% NFMA-co-MMA）浸提液和PMMA 浸提液24 h、48 h、72 h 后观察小鼠，各时间点均未出现呼吸困难、异常运动、震颤痉挛、腹泻呕吐、皮肤水肿或反应降低等症状。实验小鼠均未死亡。采用重复测量方差分析对不同时间点小鼠体质量变化量进行比较，结果显示所有实验组小鼠3 天体质量增加量相比于注射后第1 天均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。注射不同浓度p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥浸提液的小鼠各时间点体质量增加量与Ⅰ组相比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。其中Ⅱ组小鼠3 天体质量稳定增长，且增量最明显，第3 天体质量增加量为（3.56±2.52） g，增量与Ⅰ组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 腹腔注射浸提液前后小鼠体质量变化(±s,g)

表1 腹腔注射浸提液前后小鼠体质量变化(±s,g)

注：F组间是Ⅱ～Ⅶ组与Ⅰ组（空白对照组）间同一时间点小鼠体质量变化的总体比较，与空白对照组同一时间点比较，P＞0.05；F时间是各组内不同时间点小鼠体质量变化量与第1天小鼠体质量变化量的总体比较，与第1天小鼠体质量变化量比较，①P＜0.05。

组别ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦF组间/时间/交互值P组间/时间/交互值只数3333333不同时间点体质量变化量第1天1.37±0.59 2.01±0.69 0.94±0.84 0.91±0.34 1.03±0.28 0.82±0.40 1.33±0.42 1.430/9.351/1.450 0.379/＜0.001/0.203第2天1.50±0.62①2.62±1.64①1.81±1.00①1.63±0.15①1.03±0.54 1.30±0.32①1.42±0.47①第3天1.48±1.09①3.56±2.52①1.38±0.64①1.46±0.28①1.30±0.41①1.58±0.50①1.54±0.69①

2.1.2 小鼠肝脏组织学观察 为了探究p（10%NFMA-co-MMA）对小鼠的主要器官是否有毒性反应，研究了不同浓度的p（10% NFMA-co-MMA）浸提液和PMMA 浸提液对肝脏的急性毒性作用。通过病理染色观察发现，当注射p（10% NFMA-co-MMA）浸提液时，可见肝脏、汇管区细胞形态结构正常，间质无充血，无明显的炎症细胞浸润。注射不同浓度p（10% NFMAco-MMA）浸提液的小鼠肝细胞均未发现明显肿胀和疏松化，细胞未见明显变性、坏死；腹腔注射PMMA 浸提液的小鼠肝脏也未见明显毒性反应。见图2。

图2 小鼠肝脏组织学染色图像（苏木精-伊红染色）

2.1.3 小鼠肾脏组织学观察 在对小鼠肾脏的组织学观察中发现，注射不同浓度p（10% NFMA-co-MMA）浸提液和PMMA 浸提液的小鼠的肾皮质、肾髓质细胞形态结构均正常。所有实验小鼠双侧肾脏的肾小球、肾小管形态均未发现明显异常，肾小管上皮细胞未见水肿和坏死脱落，间质无炎症细胞浸润。注射p（10%NFMA-co-MMA）和PMMA 浸提液的小鼠肾脏组织学观察结果无显著差异。见图3。

图3 小鼠肾脏组织学染色图像（苏木精-伊红染色）

2.2 肌肉植入实验

2.2.1 p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥肌肉植入实验 在肌肉植入p（10% NFMA-co-MMA）样件2 周后，周围组织有较多的炎性细胞浸润，局部组织可见毛细血管增生并且有成纤维细胞支持。4 周后，炎症反应减弱，炎症细胞减少，纤维结缔组织逐渐增多。见图4。

图4 兔背部肌肉的组织学染色图像（苏木精-伊红染色）

2.2.2 PMMA 骨水泥肌肉植入实验 使用商业PMMA 骨水泥进行对比研究发现，PMMA 骨水泥植入2周后，植入物周围同样出现较多的炎性细胞浸润以及新生毛细血管；植入4 周后局部炎症细胞减少，炎症减轻，纤维结缔组织也逐渐增多。该结果与肌肉植入p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥时类似。见图5。

图5 兔背部肌肉的组织学染色图像（苏木精-伊红染色）

3 讨论

负载万古霉素、庆大霉素和克林霉素的ALBC 已经在临床治疗中广泛使用［11-13］。然而，研究表明ALBC中抗生素的爆发性释放易造成抗菌时间短，进而引起细菌耐药［14-17］。非浸出抗菌骨水泥中的抗菌基团是通过共价键稳定的结合在骨水泥中，不会洗脱，因此可产生较长时间的接触抗菌作用［18-21］。虽然非浸出抗菌骨水泥具有良好的抗菌特性，但是对于该类骨水泥的体内生物相容性研究甚少。Deb 等［5］在对季铵化单体共聚骨水泥的研究中发现，将含有15%季铵化单体的共聚骨水泥与人骨肉瘤细胞在体外培养一周后，通过电镜观察发现，实验材料与细胞间具有良好的粘附性，证明季铵化单体共聚骨水泥具有良好的体外细胞生物相容性。Sun 等［22］将丙烯酸冰片酯单体共聚物骨水泥植入小鼠背部，分别于第7 天和第28 天对植入物周围组织进行病理学观察，发现周围组织与材料接触紧密，均未出现明显的免疫炎症反应，明确证实该类聚合物具有良好的生物相容性。在本研究中，笔者对p（10%NFMA-co-MMA）骨水泥进行了动物体内生物相容性探究。

在急性全身毒性实验中，观察项目包括体质量变化、临床观察和病理学观察等。其中临床观察包括呼吸、肌肉运动、痉挛、反射等［10］。本研究通过观察给药前后小鼠一般状态、体质量变化和肝肾毒性三个基本项目，研究硝基呋喃非浸出抗菌骨水泥的体内生物相容性。在腹腔注射浸提液前及注射后24 h、48 h 和72 h 观察小鼠，各时间点均未出现呼吸困难、异常运动、震颤痉挛、腹泻呕吐、皮肤水肿或反应降低等症状。实验小鼠均未死亡。所有注射了p（10% NFMA-co-MMA）浸提液的小鼠的体质量都表现出自然增加，包括注射了原始浸提液（100%浓度）的小鼠，各时间点体质量增加量与Ⅰ组相比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。其中Ⅱ组小鼠3 天体质量稳定增长，且增加量最明显，第3 天体质量增加量为（3.56±2.52）g，增量与Ⅰ组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有注射了市售PMMA浸提液的小鼠体质量均增加，各时间点体质量增量与Ⅰ组比较差异无统计学意义（P＞0.05），该结果证明硝基呋喃抗菌骨水泥与传统的市售骨水泥均未对小鼠短期体重变化产生明显影响。根据先前研究［9］，取实验小鼠肝脏和肾脏进行组织学观察，评价急性全身毒性。本研究在对小鼠肝脏组织学观察中发现，当注射p（10% NFMA-co-MMA）浸提液时，可见肝脏、汇管区细胞形态结构正常，间质无明显充血，也未见明显的炎症细胞浸润。所有注射p（10% NFMA-co-MMA）浸提液的小鼠肝细胞均未发现明显肿胀和疏松化，细胞无明显变性、坏死，表明没有发生明显毒性反应。在对小鼠肾脏的病理学观察中发现，注射不同浓度p（10%NFMA-co-MMA）浸提液的小鼠与注射不同浓度PMMA 浸提液的小鼠的肾皮质、肾髓质细胞形态结构均正常。所有实验小鼠双侧肾脏的肾小球、肾小管形态均未发现明显异常，肾小管上皮细胞未见水肿和坏死脱落，间质无炎症细胞浸润。根据本研究组织学观察结果推测，p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥中的抗菌基团不会干扰液相剂中MMA 单体的聚合，大多数单体均参与聚合，因此可被洗脱的MMA 单体量较少，对小鼠的肝肾组织的急性毒性作用不显著。在兔背部肌肉植入实验中，通过光镜下观察植入物周围组织炎症细胞与纤维结缔组织包裹情况，评价组织反应程度［9，22］。结果发现植入2 周后的组织学切片显示骨水泥周围组织中有大量炎症细胞浸润并伴毛细血管生成，而在骨水泥植入后的第4 周，在p（10% NFMA-co-MMA）样件周围的炎症细胞减少，炎症反应减轻，结蹄组织增多，逐渐形成纤维包裹。上述病理学反应均为组织愈合过程中的积极表现。在市售的PMMA 骨水泥植入物周围也观察到了类似的现象，表明p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥与临床使用的PMMA 骨水泥具有同样良好的生物相容性。

综上所述，本研究初步表明，p（10% NFMA-co-MMA）骨水泥在动物体内具有良好的生物相容性。基于此项研究取得的进展，在未来将进一步研究该非浸出抗菌骨水泥在体内的抗菌活性。