重症医学科产KPC-2 肺炎克雷伯菌的耐药情况分析及同源性研究

戚丽敏，陈建军

1.睢宁县人民医院检验科，江苏徐州 221200；2.徐州市第一人民医院检验科，江苏徐州 221002

肺炎克雷伯菌常存在人体呼吸道及肠道内，是正常肠道微生物群的一部分，而在免疫系统明显削弱时可引发感染，特别是肺部感染，病情严重者可引发胸腔积液等并发症[1]。对此类感染者常在早期实施抗生素治疗，然而目前抗生素的滥用现象较为普遍，这导致病原菌较易产生超广谱耐药酶，进而对各抗生素产生耐药作用[2]。因此近几年临床由肺炎克雷伯菌引发的感染率明显上升，同时耐药菌株数量显著增加，这使得患者病情较易反复[3]。肺炎克雷伯菌产生对碳青霉烯类药物的耐药性主要归因于它含有的碳青霉烯酶-2（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase, KPC-2），这种酶使其能够抵抗碳青霉烯类抗生素的作用[4-5]。本研究回顾性选取2020年10 月—2022 年9 月睢宁县人民医院收治的46 例重症医学科患者的临床资料，从中提取46 株耐青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株实施耐药性和同源性分析，旨在为临床正确应用抗生素提供合理依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取本院收治的46 例产KPC-2 肺炎克雷伯菌感染患者的临床资料，送检标本中共分离出46 株耐青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株。其中痰液37例，尿液4 例，血液4 例，分泌物1 例。

1.2 方法

①药敏试验。应用革兰氏阴性菌卡片及药敏分析系统对本次研究标本进行测试，以符合美国临床与实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）相关准则做出最终判断。②对46 株耐青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株行青霉烯酶表型检测，方式为改良碳青霉烯灭活试验联合EDTA 改良碳青霉烯灭活试验。阳性、阴性菌株分别为肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、ATCC BAA1706。改良碳青霉烯灭活试验如下：将于平板上过夜孵育的1 μL 满环细菌接种至2 mL 的TSB 培养基管内，漩涡震荡10～15 s，培养管内加入美罗培南纸片，设置温度35℃，孵育4 h；用生理盐水制备大肠埃希菌ATCC25922，并使用纸片扩散法将其涂抹在琼脂培养基（Mueller Hinton Agar,MHA）培养基上，在平板上干燥3～10 min 后放置美罗培南纸片，在10 μl 接种环中取出部分TSB 培养基内的美罗培南纸片菌悬液，然后用相同接种环自培养基试管内取出美罗培南纸片，将该纸片黏附于已涂有敏感大肠埃希菌ATCC25922 的MHA琼脂表面。倒置MHA 平板，35℃孵育18～24 h，最后用纸片扩散法测量抑菌圈直径。EDTA 改良碳青霉烯灭活试验如下：在第2 个2 mL 的TSB 管内进行标记以进行实验，然后向管内加入20 μL 的0.5 mol/L 的EDTA，使之浓度为5 mmol/L，根据改良碳青霉烯灭活试验步骤进行操作，且平行处理改良碳青霉烯灭活试验管及EDTA 改良碳青霉烯灭活试验管，取出管内美罗培南纸片贴于涂有美罗培南敏感大肠埃希菌ATCC25922 的相同MHA 平板上。③耐药基因检测。用水煮法取肺炎克雷伯菌的DNA，并用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）扩增肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的耐药基因。通过凝胶电泳技术以检查扩增产物的结果。④DNA 测序。对肺炎克雷伯菌中的碳青霉烯酶阳性菌株进行PCR 扩增，然后纯化所得的PCR产物，将DNA 样本送至DNA 测序仪进行测序，测序结果与已知DNA 序列比对，确定菌株的基因型。⑤同源性分析。取17 株ICU 分离的耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌实施脉冲电泳凝胶电脉分析。分析后用溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）染色，凝胶成像，得到图像，并以此实施聚类分析，根据脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE）解释标准及Dice 系数以分析脉冲电泳凝胶电脉带型间的相似度，将80%设为相似度的临界值，从而评估不同菌株间的遗传亲缘性。

2 结果

2.1 药敏试验

待测菌对庆大霉素、阿米卡星、替加环素、复方新诺明存在敏感性。见表1。

表1 药敏试验结果[n(%)]

2.2 mCIM 及eCIM 试验

46 株耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌的mCIM 阳性，eCIM 阴性，且均为产丝氨酸碳青霉烯酶菌株。

2.3 耐药基因

经PCR 扩增，46 株待测菌株内有肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶型基因46 株，阳性率为100.00%。

2.4 DNA 测序

PCR 扩增产物测序结果证实为KPC-2 型基因。见图1。

图1 KPC-2 型基因

2.5 同源性分析

ICU 的17 株耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌同源性分析结果见图2，且该菌株可分为3 个克隆型，分别含有11 个、5 个及1 个菌株。见图2。

图2 17 株耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌同源性分析结果

3 讨论

近年来虽然耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌的检出率逐年增加，但其临床治疗难度却并未显著降低[6-7]。了解肺炎克雷伯菌的耐药机制及同源情况对于指导临床合理用药具有重要意义，并为应对耐药性问题提供了关键信息。由于ICU 患者病情较为严重，患者机体免疫力较差，因此使用抗生素种类较多，易增加耐药菌的出现。

本研究观察到，仅庆大霉素、阿米卡星、替加环素、复方新诺明对细菌有敏感性，而碳青霉烯类、头孢类及喹诺酮类药物的耐药性为100%。而在马孝煜等[8]研究结果中表明，耐青霉烯类肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率可见，耐药率最高的为氨苄西林，耐药率为100%，其次为头孢唑林，耐药率为94.44%，与本研究结果不同，原因主要为本院由于存在喹诺酮类药物的滥用现象，因此使细菌耐药性上升。

亦有相关研究表明，含有碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌对一般的抗生素表现出较强的耐药性，且感染此类耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的患者更易造成致命性结果[9]。本研究观察到，本院ICU的耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌均携带KPC-2 的编码基因，其与宋国滨等[10]研究结果相似，在其研究中，4 个ICU 病房内的耐青霉烯类肺炎克雷伯菌均以产KPC-2 为主。美罗培兰等抗菌药物对革兰氏阴性杆菌的多重感染具有较好临床疗效。碳青霉烯类抗菌药的耐药机制为产KPC-2，其可水解青霉素类、碳青霉烯类等抗菌药，碳青霉烯酶是一种Bush-2f Ambler-A 类型的β-内酰胺酶，其可有效水解β-内酰胺结构，是造成肺炎克雷伯菌耐药的重要因素[10]。本研究观察到，46 株耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌的mCIM 联合eCIM 试验结果与碳青霉烯酶基因检测结果符合率为100%。说明mCIM 联合eCIM 试验对筛选菌株产生碳青霉烯酶具有显著作用，其对于临床用药具有重要意义[11]。本研究观察到，经同源性分析结果可见，本院ICU 分离的耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌中相同克隆型内菌株之间具有极高相似性，表明此类菌株由两个主要克隆型的克隆播散造成。分析原因主要为，医院ICU治疗环境相较于其他科室较为封闭，且医院人力资源有限，若在对患者进行治疗时若未能够根据无菌操作严格执行，则细菌在温和、封闭环境下极易出现增殖传染情况[12-13]。此外ICU 转入其他科室的患者也会携带细菌造成细菌传播情况。

综上所述，产丝氨酸碳青霉烯酶是造成ICU 分离耐青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制，酶基因为KPC-2 型，且本院重症医学科存在耐碳青霉烯肺炎克雷伯的克隆传播。因此医院医护人员应及时隔离感染患者，强化相关无菌操作及无菌意识，尽可能预防医院感染的发生。但本研究不足之处在于，由于研究时间及研究经费等原因，46 株耐青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株中仅17 株实施了同源分析。