波形蛋白糖基化突变质粒对PC12细胞分化的影响研究*

邵晓婷,戴玉璇,应玲静,陈美仙

(浙江大学医学院附属金华医院/金华市中心医院儿科,浙江金华 321000)

蛋白糖基化是将聚糖基团添加到蛋白分子中[1],通过调节蛋白分子的结构、稳定性及功能等,使其在生物体内多种生理及病理过程中发挥重要作用[2-3]。糖基化与机体内许多生物学作用及多种疾病息息相关[4-5],糖基化修饰可以影响细胞的许多生理特性,例如分子间相互作用、识别及后续的生物调节功能等。外源性寡糖化合物(Cyclo-ManN propanyl perac,Cyclo-ManN pro)可以使糖复合物发生糖基化修饰。糖基化修饰在大鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12细胞)分化中发挥重要调节作用[6],而糖基化作用促进PC12细胞分化的具体机制尚不明确,作者前期实验中发现波形蛋白(vimentin)是糖代谢分子作用PC12细胞的重要中间蛋白。波形蛋白是一种潜在的糖蛋白,有3个潜在糖基化位点(7:丝氨酸;33:苏氨酸;34:丝氨酸),为了进一步研究糖基化在PC12细胞中的作用,本研究构建波形蛋白糖基化位点突变质粒,并研究其对PC12细胞分化的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

PC12细胞购于中国科学院上海分院;Cyclo-ManN pro受赠于WERMER RUETTER教授;引物合成由上海生工生物工程公司完成;pcDNA3.1b购于美国Invitrogen公司;PCR试剂PrimeSTAR、dNTP购于天根生化科技(北京)有限公司,M-MLV逆转录酶购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司;限制性内切酶(EcoRⅠ/XbaⅠ)、四碘甲状腺原氨酸(T4)连接酶购于日本TaKaRa公司;大肠杆菌菌株Top10来源于复旦大学上海医学院生化系存种;凝胶电泳试剂购于法国Biowest公司;DNA标记物购于天根生化科技(北京)有限公司;RNA抽提试剂盒购于上海星汉生物科技有限公司,胶回收试剂盒购于安徽省优晶生物工程有限公司,质粒抽提试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;超净工作台购于上海净化设备有限公司;倒置显微镜购于安徽安庆市医疗器械有限公司;荧光显微镜购于日本Olympus公司;核酸电泳槽购于北京六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1构建波形蛋白相关质粒

目的基因片段获取:PC12细胞RNA抽提,获取波形蛋白的mRNA,通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR),获取波形蛋白的cDNA,设计引物,PCR分别获取波形蛋白正常基因片段和糖基化突变基因片段。重组质粒建成与分析:分别将pcDNA3.1b与波形蛋白双酶切(EcoRⅠ/XbaⅠ)后连接,转进大肠杆菌细胞,筛选氨苄青霉素阳性克隆菌,培养,抽提质粒并电泳鉴定,送于上海生工生物工程公司进行测序。RT-PCR反应体系:RNA 2 μg、5×RNA PCR Buffer 4 μL、MgCl24 μL、10 mmol/L dNTP Mix 8 μL、Oligo dT 1 μL、MML enzyme 1 μL、DEPC超纯水加至20 μL。反应条件:预变性65 ℃ 5 min,逆转录酶37 ℃ 1 h,99 ℃ 5 min,5 ℃ 5 min,-20 ℃保存。PCR反应体系:Template 0.5 μL、Primer(sense) 0.5 μL、Primer(Antisense) 0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 1 μL、PrimeSTAR 0.5 μL、超纯水 19.5 μL。PCR反应条件:波形蛋白(98 ℃ 5 min,98 ℃ 30 s,67 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35个循环);波形蛋白糖基化位点突变(98 ℃ 5 min,98 ℃ 30 s,66 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35个循环)。

1.2.2细胞培养及分化分析

(1)采用含10%胎牛血清DMEM培养基,在37 ℃、5% CO2的条件下培养PC12细胞,细胞密度约为1×104个/cm2时进行形态观察。(2)细胞密度达到70%～80%时分别转染不同质粒:对照组转染空载质粒pcDNA3.1b,Vim组转染波形蛋白正常基因片段重组质粒,Vim mut组转染波形蛋白糖基化位点突变基因片段重组质粒。继续保持37 ℃、5% CO2的条件下培养,分别在0、3 d时记录细胞分化情况。(3)细胞分化情况分析:随机选取3个不同的视野,不少于150个细胞数量,统计分化神经突平均长度与分化细胞占比(分化细胞为拥有至少1个神经突>10 μm的细胞)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 波形蛋白糖基化位点突变目的基因情况

在Uniprot数据库中分析发现波形蛋白含有3个潜在糖基化位点(7:丝氨酸;33:苏氨酸;34:丝氨酸),通过前后两个片段将这3个位点全部突变,设计引物将位点19(T-G)、97(A-G)、100(T-G)突变,从而实现氨基酸序列突变[7:丝氨酸(S)变为丙氨酸(A);33:苏氨酸(T)变为丙氨酸(A);34:丝氨酸(S)变为丙氨酸(A)]。前108 bp片段(正向引物:5′-AAA GAA TTC ATG TCC ACC AGG TCC GTG GCC TC-3′,反向引物: 5′-AAA GCG GGT GGC TGC GGT CAC ATA G-3′),后1 346 bp片段(正向引物:5′-AAA TAT GTG ACC GCA GCC ACC CGC-3′,反向引物:5′-AAA TCT AGA TAC TGC GCC GTT GCA CTG AGC CT-3′),突变全长基因片段(正向引物:5′-AAA GAA TTC ATG TCC ACC AGG TCC GTG GCC TC-3′,反向引物:5′-AAA TCT AGA TAC TGC GCC GTT GCA CTG AGC CT-3′),含EcoR Ⅰ酶切位点及Xba Ⅰ酶切位点。目的基因片段进行PCR扩增后进行凝胶电泳分析,波形蛋白基因约1 404 bp,凝胶电泳结果分析,分别于近100 bp(图1A)、1 000～2 000 bp(图1B)、1 000～2 000 bp(图1C)处显示目的片段,见图1。

A:前108 bp片段电泳图;B:后1 346 bp片段电泳图;C:全长基因片段电泳图;箭头示目的片段。

2.2 波形蛋白糖基化突变重组质粒的鉴定

重组质粒为包含波形蛋白突变基因片段(约1 404 bp)的重组体,在同一电泳条件下,Vim mut组电泳速率慢于对照组,见图2。

A箭头示目的片段。

2.3 Cyclo-ManN pro处理前细胞分化分析

分别将空载质粒pcDNA3.1b、波形蛋白质粒、波形蛋白糖基化位点突变质粒转染进PC12细胞,培养3 d观察细胞分化情况(图3A)。Vim组细胞平均神经突长度为(61.98±19.03)μm,高于对照组的(51.09±14.45)μm、Vim mut组的(51.49±14.78)μm,差异有统计学意义(P<0.05);Vim组分化神经突细胞百分比为(6.60±0.25)%,高于对照组的(4.27±0.18)%、Vim mut组的(4.76±0.33)%,差异有统计学意义(P<0.05),提示波形蛋白糖基化位点在PC12细胞分化中发挥重要作用,见图3。

A:细胞形态分化图(100×);B:细胞平均神经突长度定量结果图;C:分化细胞百分比定量结果图;a:P<0.05。

2.4 Cyclo-ManN pro处理后细胞分化分析

进一步观察转染上述3组质粒在Cyclo-ManN pro作用下对PC12细胞分化的影响。结果显示,Cyclo-ManN pro处理后,Vim组细胞平均神经突长度为(78.01±18.31)μm,高于对照组的(69.98±12.85)μm、Vim mut组的(68.45±13.84)μm,差异有统计学意义(P<0.05);Vim组分化神经突细胞百分比为(10.62±0.25)%,高于对照组的(8.11±1.22)%、Vim mut组的(5.89±0.60)%,差异有统计学意义(P<0.05),提示Cyclo-ManN pro可能是通过波形蛋白糖基化位点作用而促进细胞分化的,将糖基化位点突变后,Cyclo-ManN pro促进神经分化的作用则会明显降低,见图4。

3 讨 论

糖基化作用是一种重要的翻译后修饰作用,可以参与多种生物代谢过程,其异常代谢会引起机体各种相关疾病[7-8]。翻译后修饰可以扩大蛋白多样性从而改变其生物功能,在许多生理和病理过程中发挥重要作用,例如细胞复制、细胞凋亡、转录调节、翻译调节、信号转导、免疫调节等[9-11]。在真核生物中有两种主要蛋白糖基化类型:N连接型糖基化、O连接型糖基化。O连接型糖基化通常将聚糖分子连接到丝氨酸/苏氨酸基团的羟基上[12]。波形蛋白含有3个糖基化位点(7:丝氨酸;33:苏氨酸;34:丝氨酸),可能是一种潜在的O连接型糖基化蛋白。有研究显示,O连接型糖基化在许多蛋白功能中发挥作用,包括蛋白细胞定位、蛋白稳定性、蛋白间相互作用等[13]。O连接型糖基化还与磷酸化修饰间有交互作用,可能是因为它们都可作用于蛋白分子的丝氨酸/苏氨酸基团[14]。神经节苷脂的糖基化修饰可以通过影响细胞的存活与凋亡来参与早期脑发育[15]。唾液酸代谢前体物质可以使细胞中的糖复合物发生糖基化修饰作用[16-17]。

波形蛋白是一种Ⅲ型中间纤维蛋白,是最为熟知并被广泛研究的中间纤维蛋白家族成员,有着重要的生物学功能,但其具体功能并未被充分了解。有研究显示,波形蛋白在神经元轴突生长中发挥重要作用[18]。波形蛋白发生翻译后修饰可以影响其生物学功能[19],在神经轴突生长中发挥重要作用[20],其中糖基化修饰作用是波形蛋白一种重要的翻译后修饰[21],然而波形蛋白糖基化修饰的相关机制及后续对PC12细胞的生物学功能影响尚未明确。本研究中,使用Cyclo-ManN pro研究波形蛋白糖基化修饰对PC12细胞神经分化的影响。在Uniprot数据库中对波形蛋白进行生物信息学分析,发现该蛋白有3个潜在糖基化位点,将这3个糖基化位点均进行突变,并构建相应糖基化位点突变质粒,转染至PC12细胞来进一步研究其对神经分化的影响。结果显示,波形蛋白糖基化修饰可以延长细胞平均神经突的长度,提高分化细胞的比例,促进PC12细胞的神经突分化与生长。在后续研究中,将设计引物,对波形蛋白的3个糖基化位点分别单独进行突变,构建相应的糖基化位点7、33、34突变质粒,通过进一步转染PC12细胞来分析其对神经分化的影响,从而分析具体位点突变对PC12细胞神经分化的作用。

波形蛋白是一种可能的O连接型糖基化蛋白,作用于丝氨酸/苏氨酸基团,而丝氨酸/苏氨酸基团同时也是磷酸化位点,可被蛋白激酶A/C磷酸化,这两种修饰间存在交互作用。在神经细胞中,波形蛋白可被周期蛋白依赖性激酶1磷酸化,并参与整合素β1的激活及后续信号通路,从而在神经轴突生长及再生等方面中发挥作用。因此,波形蛋白糖基化可能通过磷酸化交互作用影响后续细胞神经分化,相关作用机制可能是今后的研究方向。