痛风石组织中巨噬细胞BCAS3和RFX3蛋白表达及意义*

董淑慧,徐 瑾

(天津市天津医院病理科,天津 300211)

痛风是一组由于长期嘌呤代谢紊乱导致的以单钠尿酸盐晶体沉积为特征的疾病,以痛风性关节炎最为常见,其特征是血尿酸升高导致尿酸盐晶体沉积在关节腔、软骨、滑膜及周围组织,引起局部关节突发疼痛、红肿,反复发作可引起关节僵硬、变形,严重影响生活质量。痛风还可诱发痛风石、痛风性眼病、痛风性心脏病。临床资料显示,痛风还与脑血管疾病、代谢综合征、糖尿病、肾脏疾病等有着密不可分的联系,与其他合并症一起,可以使患者的预期寿命总体下降[1-3]。近年来,由于我国经济水平的提高和人们饮食结构的改变,痛风的发病率明显升高,患病率为0.03%～10.47%[4];高尿酸血症的发病还有明显年轻化的趋势[5]。目前高尿酸血症和痛风在我国已成为一种常见的代谢性疾病。

目前认为遗传、炎症及免疫因素参与了痛风的发病[6],遗传因素是主要因素。我国汉族人群的首个大样本量全基因组关联分析(GWAS)显示,人类乳腺癌扩增序列3(BCAS3)和调节因子X3(RFX3)是我国人群特有的痛风易感基因[7]。单核巨噬细胞是参与痛风发病的主要炎症细胞[8],是痛风石中数量最多的细胞。因此,本研究选择手术切除的痛风石标本,应用免疫组织化学方法检测痛风石中巨噬细胞的BCAS3和RFX3蛋白表达情况,分析两种蛋白参与痛风的发病机制和对于痛风的诊断价值,以期为临床预防、诊断和治疗痛风筛选靶向药物提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年4月至2022年12月本院痛风石切除标本30例为试验组,均为男性,年龄(45.73±17.63)岁,血尿酸(577.04±145.89)μmol/L。同期切除的关节置换术后滑膜增生伴有异物巨细胞反应的标本25例、脂肪坏死伴有巨噬细胞增生的标本5例作为对照组,其中男16例,年龄(57.44±17.60)岁,血尿酸(343.92±104.93)μmol/L,女14例,年龄(60.86±15.41)岁,血尿酸(273.15±75.68)μmol/L。纳入标准:(1)依据2013年中华医学会内分泌学分会《高尿酸血症和痛风治疗的专家共识》标准[9],试验组患者空腹血尿酸均>420 μmol/L;(2)痛风石标本均经组织印片偏光显微镜检确认尿酸盐晶体的存在,见图1。排除标准:(1)具有类似表现的假痛风、类风湿关节炎等;(2)对照组患高尿酸血症(男性空腹血尿酸>420 μmol/L,女性>360 μmol/L)、高血压、冠心病、糖尿病、肿瘤等。

图1 偏光显微镜下尿酸盐晶体(100×)

1.2 方法

1.2.1仪器与试剂

LEICA全自动免疫组织化学染色机,BCAS3单克隆抗体(克隆号DF9291)、RFX3多克隆抗体(克隆号ZC-4066)浓缩液购自上海茁叶生物科技有限公司;CD68、CD163抗体工作液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2免疫组织化学染色

将标本行3 μm挂胶切片,60 ℃烤箱烘烤2 h,在LEICA全自动免疫组织化学染色机上进行染色,常规脱水、透明、封片后镜检。CD68、CD163抗体为工作液;浓缩液按照使用说明书适度稀释,BCAS3抗体稀释浓度为1∶100,RFX3抗体稀释浓度为1∶150。人肾脏组织和脑组织作为阳性对照,同时采用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3评分判断标准

CD68、CD163定位于巨噬细胞的细胞质,对二者定位的细胞进行BCAS3和RFX3的染色结果判读,阳性的标准定为棕褐色、棕黄色与黄色颗粒状着色。根据巨噬细胞的染色强度和阳性细胞所占比例进行评分。颜色越深则分数越高,棕褐色、棕黄色、黄色分别记为3、2、1分,没有着色记0分;在巨噬细胞密集区随机观察5个高倍视野(400×),在每个视野中计数100个巨噬细胞,一共计数500个巨噬细胞,阳性细胞所占比例≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%和>75%分别记为0、1、2、3和4分。两种评分结果相加为最终得分。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各个抗体的细胞定位情况

CD68、CD163均定位于巨噬细胞的细胞质,多核巨噬细胞多表达CD68(图2),单核巨噬细胞多表达CD163(图3),二者相互补充标示出组织中的巨噬细胞。BCAS3定位于巨噬细胞的细胞核和细胞质(图4),而RFX3主要定位于细胞质(图5)。

图3 痛风石中巨噬细胞表达CD163(200×)

图4 痛风石中巨噬细胞表达BCAS3(200×)

图5 痛风石中巨噬细胞表达RFX3(200×)

2.2 BCAS3、RFX3蛋白表达情况及相关性分析

试验组BCAS3、RFX3蛋白表达明显高于对照组(t=3.036、8.617,P=0.004、0.001),对照组不同性别BCAS3、RFX3蛋白表达比较差异无统计学意义(t=0.158、0.882,P=0.876、0.386),见表1。

表1 两组BCAS3、RFX3蛋白表达比较

试验组BCAS3蛋白表达与RFX3蛋白表达呈正相关(r=0.539,P=0.002)。试验组血尿酸与BCAS3、RFX3蛋白表达均呈正相关(P<0.05),对照组血尿酸与BCAS3、RFX3蛋白表达不相关(P>0.05)。两组年龄与BCAS3、RFX3蛋白表达不相关(P>0.05),见表2。

表2 血尿酸、年龄与BCAS3和RFX3的相关性分析

2.3 BCAS3、RFX3对痛风的诊断效能

RFX3的曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度分别为0.935、96.55%、86.67%,均高于BCAS3的0.742、70.00%和80.00%,说明RFX3对于痛风有更高的诊断价值,见表3、图6。

表3 BCAS3和RFX3对痛风的诊断效能

图6 ROC曲线分析

3 讨 论

BCAS3位于染色体17q23,全长600 kb,含有24个外显子,能够编码913个氨基酸,是一种细胞骨架蛋白,最早在乳腺癌组织中被发现过表达[10]。随着研究的深入,BCAS3被认为和多种疾病相关,如脑肿瘤、肾脏疾病和原发性开角型青光眼等。LI等[11]发现,BCAS3的3个单核苷酸基因位点(rs9895661、rs9905274和rs11653176)的多态性与我国汉族男性人群的痛风相关联。赵会文[12]研究发现,BCAS3单核苷酸基因多态性可能与我国沿海地区汉族男性人群的痛风易感性相关。痛风急性期和缓解期患者的外周血单个核细胞中BCAS3 mRNA表达均较健康人群明显升高(P<0.05),推测rs9905274和rs11653176两个位点的单核苷酸多态性可能会影响BCAS3的表达从而调节单核细胞的功能,进而促进白细胞介素(IL)-1β等炎性因子的释放,导致痛风的发生。

本研究发现,试验组BCAS3蛋白表达明显高于对照组,说明BCAS3蛋白表达上调能够调节巨噬细胞的功能来参与痛风的发病。JOSHI等[13]研究发现,BCAS3 作为一种细胞骨架蛋白,通过偶联微管、中间丝,能够促进血管发育过程中内皮细胞的迁移。据此,推测BCAS3也可能通过调节巨噬细胞的迁移能力来参与痛风的发病。作为一种炎症性疾病,痛风的发病过程涉及巨噬细胞的极化和焦亡现象。在痛风的急性期巨噬细胞倾向于向M1型极化,释放促炎因子,导致剧烈的炎症反应;而在痛风的缓解期,巨噬细胞倾向于向M2型极化,抑制炎症的发展和促进炎症的消退,这可部分解释痛风发作的“自限性”[14]。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡方式,通过细胞肿胀并破坏细胞膜的完整性,造成细胞穿孔,细胞内代谢产物和炎性因子释放,产生并扩大炎症反应,是一种促炎程序性死亡。研究表明,抑制巨噬细胞焦亡可以减少活化的IL-1β释放,从而缓解痛风的炎性反应[15]。巨噬细胞的极化和焦亡过程均涉及很多细胞因子和传导通路,细胞骨架蛋白也必不可少地参与其中。作为一种细胞骨架蛋白的BCAS3是否在痛风发生的不同阶段通过调节巨噬细胞的极化和焦亡来参与痛风的发病还有待进一步的研究。

RFX3是纤毛形成和功能调节的关键性转录因子之一。纤毛是存在于大多数脊椎动物细胞表面的保守细胞器,能够感知对于细胞增殖、分化、极性调节和组织动态平衡至关重要的各种细胞外信号[16-17]。本研究发现,试验组RFX3蛋白表达高于对照组(P<0.05),说明巨噬细胞通过高表达RFX3参与痛风的发病。巨噬细胞在免疫系统中发挥着重要作用,包括感知和吞噬异物、提呈抗原、释放促炎因子、招募炎症细胞等[18]。这些功能的实现很大程度上依赖于对肌动蛋白的调控[19]。肌动蛋白细胞骨架是一个高度平衡的动态网络系统,参与如细胞迁移和膜运输等重要的生物学过程,其基本功能是通过聚合作用来改变脂膜的结构[20]。其中重要的一员是生长的肌动蛋白细丝(F-actin),其有助于维持细胞形状,建立和维持与细胞运动相关的膜突起,促进囊泡的运输[21]。这些复杂的细胞功能的实现需要对F-actin的产生、稳定和周转进行精密的时间和空间调节。有研究表明,分枝的F-actin对纤毛的形成有抑制作用[22]。

李脉超[23]发现巨噬细胞特异性RFX3基因敲除小鼠的巨噬细胞黏着斑增大,足小体增多,F-actin荧光强度增加,迁移能力增强,提示RFX3基因可能是通过促进F-actin 的产生从而抑制纤毛形成,改变巨噬细胞的迁移能力。同时,尿酸盐介导的腹膜炎模型中条件性敲除RFX3小鼠腹腔灌洗液中IL-1β水平较对照组有明显下降,表明敲除RFX3基因后,炎症情况有所改善,RFX3在痛风的发病过程中具有促炎的作用[23]。这一研究部分解释了RFX3参与痛风的发病机制。

本研究发现,试验组BCAS3蛋白表达与RFX3蛋白表达呈正相关(r=0.539,P=0.002),说明二者在痛风的发病过程中可能具有一定的协同作用。虽然是比较弱的正相关,但二者都具有明确的促炎作用,均促进了痛风的发病。二者具体的相互关系和作用机制,需待相关通路研究清晰后确定。同时,试验组血尿酸与BCAS3、RFX3蛋白表达均呈正相关(P<0.05),且RFX3的相关系数更高。由此推测,从遗传因素方面,对于高尿酸血症和痛风的发生,RFX3可能起到比BCAS3更为重要的作用。

ROC曲线分析显示,RFX3对于痛风具有较高的诊断价值(AUC、灵敏度和特异度分别为0.935、96.55%和86.67%),说明巨噬细胞中RFX3在痛风发生过程中所起的作用较BCAS3更明显。对于缺乏临床症状而组织中发现可疑结晶沉积的患者,BCAS3和RFX3在巨噬细胞中的高表达(>5.30和>1.80)提示痛风的可能,为临床诊断不典型痛风提供了新的途径。

综上所述,痛风石中巨噬细胞通过高表达BCAS3和RFX3参与痛风的发生。BCAS3可能是通过促进IL-1β等炎性因子的表达和释放等方面参与痛风的发生,而RFX3可能是通过改变巨噬细胞的迁移能力并通过促炎作用参与痛风的发病,在痛风的发生过程中二者可能具有一定的协同促进作用。RFX3可能起到比BCAS3更为重要的作用,并且二者在巨噬细胞中的高表达对于痛风具有较高的诊断价值,为临床诊断不典型的痛风和开发治疗痛风的靶向药物提供了理论依据。其中涉及的具体通路和相关蛋白还需要进一步的研究证实。