基于Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路调控巨噬细胞极化探讨复方雷公藤制剂改善关节炎症的机制

赵 磊,万 磊,刘 健,黄传兵,贾光辉,朱子衡,胡恩钦,娄渊和

(1. 界首市人民医院,安徽 界首 236500;2. 安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031;3. 新安医学教育部重点实验室,安徽 合肥 230038)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以大量炎症细胞伴随滑膜、软骨组织损伤的慢性自身免疫性疾病,影响全球约1 %的人口,其特征是炎症和血管翳形成,随后关节和软骨退化[1-2]。虽然治疗RA的药物很多,但效果均不是很理想,且长期用药不良反应明显[3]。近些年生物制剂治疗RA的疗效得到肯定,但患者对治疗的临床反应表现出高度的异质性[4]。中医中药可通过多靶点和整体调节作用控制RA病情,且能减少西药所致的不良反应[5]。复方雷公藤制剂(新风胶囊)为新安医家刘健教授据多年临床经验所创,广泛用于治疗RA及免疫相关疾病。课题组临床研究表明,复方雷公藤制剂可能通过调控炎性细胞因子和趋化因子平衡,抑制FAK/CAPN/PI3K通路异常激活而改善RA患者体内炎症反应及关节症状[6];动物实验研究表明,复方雷公藤制剂可通过调节巨噬细胞极化改善佐剂关节炎(AA)大鼠关节炎症[7]。但复方雷公藤制剂调控巨噬细胞极化的作用机制尚不明确,故本实验以Notch信号通路调控巨噬细胞极化为研究突破口,并以复方雷公藤制剂调控为切入点,研究了复方雷公藤制剂调节RA巨噬细胞极化平衡的机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 清洁级SD雄性大鼠30只,体重(190±20)g,由安徽医科大学实验动物中心提供,动物合格证号:Lscxk(皖)2017-001。大鼠饲养于温度18～22 ℃、相对湿度50%～60%的标准清洁级动物房,保持通风排气10～20次/h。本实验经安徽中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准(AHUCM-rats-2021022)。

1.2药物及试剂 复方雷公藤制剂(由雷公藤、黄芪、薏苡仁、蜈蚣配伍组成,安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供,皖药制字号Z20050062,批号:191015,规格:0.34 g/粒);甲氨蝶呤(上海上药信谊药厂有限公司,国药准字H22022674,批号:191213,规格:2.5 mg/片);Notch1抑制剂(上海蓝木化工有限公司,货号:S7399);弗氏完全佐剂(美国Sigma公司,货号:MB9887);白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-13(IL-13)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) ELISA检测试剂盒(武汉基因美科技有限公司,货号分别为JYM0083Hu、JYM0142Hu、JYM0155Hu、JYM0151Hu、JYM0110Hu,批号均为GR2021-10);抗鼠M1型巨噬细胞标志物(CD86-PE)、M2型巨噬细胞标志物(CD206-AF647)(美国Santa Cruz公司,货号分别为Sc19617、S58986);山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、β-actin(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号分别为ZB-2305、ZB-2305、TA-09);兔Notch1、Jagged1、Hes1抗体(英国abcam公司,货号分别为ab52627、ab109536、ab119776);兔RBP-Jκ抗体(中国bioss公司,货号:bs-2966R)。

1.3仪器 流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司,型号:navios);倒置显微镜(日本OLYMPUS公司,型号:CKX31);离心机(上海和欣科教设备有限公司,型号:80-2);电泳仪(上海天能科技有限公司,型号:EPS300);生物组织自动脱水机、生物组织包埋机、生物组织摊烤片机(湖北亚光公司,型号分别为ZT-12M、YB-7LF、YT-7FB)。

1.4实验方法 将30只大鼠随机分为正常组、模型组、复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组,每组6只。除正常组不造模外,其余组大鼠参考文献[8-9]方法向右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(0.1 mL/只)构建佐剂关节炎模型。致炎后第19天开始,根据人与动物体表面积比值[10]计算给药剂量,复方雷公藤组给予340 mg/L复方雷公藤制剂混悬液(将复方雷公藤制剂粉末溶于0.9%氯化钠溶液制成)灌胃,每天1次;甲氨蝶呤组给予0.95 mg/L甲氨蝶呤混悬液(甲氨蝶呤片研成细粉后溶于0.9%氯化钠溶液制成)灌胃,每周1次;Notch1抑制剂组给予0.56 mg/L Notch1抑制剂混悬液(将Notch1抑制剂溶于0.9%氯化钠溶液制成)尾静脉注射,隔天1次;正常组及模型组给予生理盐水10 mL/kg灌胃,每天1次。各组均连续干预30 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1足趾肿胀度、关节炎指数 造模前1 d、干预前1 d、干预30 d后测量各组大鼠足趾容积,计算干预前1 d、干预30 d后的足跖肿胀度、关节炎指数。足跖肿胀度=(造模后足趾容积-造模前足趾容积)/造模前足趾容积。关节炎病变指数按5级评分法评价,无红肿现象为0分,小趾关节出现红肿为1分,趾关节和足跖出现肿胀为2分,踝关节以下的足爪发生肿胀为3分,包括踝关节在内的全部足爪发生肿胀为4分[11]。

1.5.2外周血炎症极化标志物CD86、CD206表达情况 末次干预结束后麻醉大鼠,取腹主动脉血100 μL,按照说明书每106个细胞/管分别加入抗鼠CD86-PE、CD206-AF647各0.25 μg,涡旋混匀后避光室温染色20 min;加入1 mL红细胞裂解液,4 ℃静置15 min,2 500 r/min 室温离心10 min,弃上清;用预冷PBS 500 μL重悬细胞,2 500 r/min 室温离心5 min,弃上清;用预冷PBS 500 μL重悬细胞,上机检测;用 flowJoV10软件对流式细胞图像进行分析。

1.5.3血清炎症因子水平 腹主动脉采血,离心取上清液,依照ELISA试剂盒说明检测IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α水平。

1.5.4关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白表达情况 分别采用免疫组化和免疫印迹法检测。

1.5.4.1免疫组化检测方法 处死各组大鼠,取右后肢关节滑膜组织,切片后放入干燥箱66 ℃烤片20～30 min;二甲苯处理,3×5 min;梯度乙醇处理(100%,95%,80%),每次3 min;将切片放入烧杯中,流水缓慢冲洗,洗去乙醇至切片干净透明;脱水后加入Notch1(1∶50)、Jagged1(1∶350)、RBP-Jκ(1∶50)、Hes1(1∶200)一抗4 ℃孵育过夜,结合山羊抗兔二抗、DAB显色、封片,显微镜观察Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1阳性表达情况并拍照。

1.5.4.2免疫印迹检测方法 用蛋白提取试剂盒提取滑膜总蛋白,电泳分离,采用半干法转膜使蛋白质从胶转移至膜上,用室温5%的脱脂奶粉封闭膜2 h。免疫反应:将兔Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1抗体1∶2 000稀释,和膜室温下孵育2 h,采用Anti-Rabbit二抗(稀释比例均为1∶8 000)室温孵育1 h。采用增强化学发光法显色并拍照。计算各组目的蛋白条带的灰度值,以条带与各组内参β-actin灰度值的比值作为相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠足趾肿胀度比较 造模前1 d各组大鼠足容积与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);干预前1 d,各造模组大鼠足趾肿胀度均明显高于正常组(P均<0.05),各造模组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05);干预30 d后,模型组大鼠足趾肿胀度明显高于正常组(P<0.05),复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组大鼠足趾肿胀度均明显低于模型组(P均<0.05);3个给药组大鼠足趾肿胀度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和佐剂关节炎各组大鼠足趾肿胀度比较

2.2各组大鼠关节炎指数比较 干预前1 d,各造模组大鼠关节炎指数均明显高于正常组(P均<0.05),各造模组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05);干预30 d后,模型组大鼠关节炎指数明显高于正常组(P<0.05),复方雷公藤组、甲氨蝶呤组大鼠关节炎指数均明显低于模型组(P均<0.05),Notch1抑制剂组大鼠关节炎指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);3个给药组大鼠关节炎指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和佐剂关节炎各组大鼠关节炎指数比较

2.3各组大鼠血清炎症因子水平比较 与正常组比较,模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明显升高(P均<0.05),血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组血清IL-1β、TNF-α水平均明显降低(P均<0.05),血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显升高(P均<0.05);复方雷公藤组血清IL-1β、TNF-α水平均明显低于甲氨蝶呤组和Notch1 抑制剂组(P均<0.05),血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显高于甲氨蝶呤组(P均<0.05)。见表3。

表3 正常组和佐剂关节炎各组大鼠血清炎症因子水平比较

2.4各组大鼠外周血炎症极化标志物CD86、CD206表达情况比较 与正常组比较,模型组大鼠外周血CD86表达占比明显升高(P<0.05),CD206表达占比明显降低(P<0.05);与模型组比较,复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组大鼠外周血CD86表达占比均明显降低(P均<0.05),CD206表达占比均明显升高(P均<0.05);复方雷公藤组大鼠外周血CD86表达占比均明显低于甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组(P均<0.05),CD206表达占比均明显高于甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组(P均<0.05)。见表4。

表4 正常组和佐剂关节炎各组大鼠外周血炎症极化标志物CD86、CD206表达占比比较

2.5各组大鼠关节滑膜组织中Notch1、Jadded1、RBP-Jκ、Hes1蛋白表达情况比较 模型组Notch1、Jadded1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05);复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组Notch1、Jadded1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05);复方雷公藤组Notch1、Jadded1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达量均明显低于甲氨蝶呤组(P均<0.05),且Jadded1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达量均明显低于Notch1抑制剂组(P均<0.05)。见图1、图2及表5。

图1 正常组和佐剂关节炎各组大鼠关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白阳性表达情况(免疫组化染色,×200)

图2 正常组和佐剂关节炎各组大鼠关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白表达条带

表5 正常组和佐剂关节炎各组大鼠关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达量比较

3 讨 论

RA是一种慢性进展性免疫炎症性疾病,会导致关节软骨退化和骨侵蚀,目前治疗方案主要是抑制炎症、延缓疾病进展。中医认为RA多存在“脾虚湿盛、痰瘀胶着”的特点[12]。复方雷公藤制剂即根据该病机特点而创制,方中雷公藤有祛风除湿、通络镇痛之功,现代研究表明雷公藤具有抗炎、免疫抑制作用[13];薏苡仁健脾利湿、舒筋除痹,薏苡仁提取物能通过抑制促炎因子表达和减轻氧化应激反应发挥抗RA的作用[14];黄芪益气养血固表,其有效成分黄芪多糖具有免疫调节作用[15];蜈蚣祛风止痉、通络止痛,其有效成分蜈蚣多肽具有明显抗炎镇痛作用[16]。诸药合用,共奏健脾化湿、通络止痛之功,且能制约雷公藤的毒性。

巨噬细胞极化参与RA炎症反应,其可大量分泌促炎性细胞因子,激活成纤维细胞和破骨细胞,加速机体炎症反应,造成关节破坏[17-19]。Notch信号通路协调许多细胞过程,可调节免疫细胞,促进巨噬细胞极化参与炎症反应[20-21]。有研究表明, Notch1可以促进TNF-α诱导的RA滑膜细胞的增殖和炎症因子的分泌,从而延迟巨噬细胞的凋亡,促进机体炎症的发生和扩散;同时研究发现Jagged1在滑膜增生性病变的滑膜衬里和亚衬里细胞中过度表达[22-23]。当Notch1受体和Jagged1配体相互接触结合后,其跨膜细胞内段在分泌蛋白酶(如解聚素及金属蛋白酶和γ-分泌蛋白酶)的作用下裂解入核,结合下游信号蛋白形成转录复合物,与转录因子RBP-Jκ结合,从而影响靶基因Hes1的表达,致巨噬细胞向M1型极化,诱导IL-1、IL-13、TNF-α炎症细胞因子浸润,参与RA炎症反应[24-25]。另外Choi等[26]研究表明,Notch1信号通路可通过抑制调节性T细胞群的数量,促进TNF-α的产生,从而促进关节炎症的发展。因此,RA的发生发展及其关节炎症反应可能与Notch通路及其巨噬细胞极化有关。

本研究中模型组外周血CD86表达量及血清IL-1β、TNF-α水平和关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达量均明显升高,外周血CD206表达量及血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显降低,说明AA大鼠体内Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路被异常激活,且该信号通路与巨噬细胞炎症极化之间存在相关性,巨噬细胞极化促进了巨噬细胞向M1型巨噬细胞的极化,从而引起炎症细胞因子的大量分泌,促进AA大鼠体内炎症免疫反应,造成关节、软骨等的损伤。复方雷公藤组外周血CD86表达量及血清IL-1β、TNF-α水平和关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达量均明显降低,外周血CD206表达量及血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显升高,且复方雷公藤的作用与Notch1抑制剂的作用不相上下,说明复方雷公藤制剂具有Notch1抑制剂样作用,可通过抑制Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路的异常激活,抑制巨噬细胞炎症极化,减轻炎症免疫反应损伤。

综上所述,复方雷公藤制剂能调节Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路调控巨噬细胞炎症极化,调节炎症免疫反应,从而抑制炎症因子对关节、软骨等的刺激和破坏。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。