壳聚糖及其衍生物促进糖尿病创面愈合研究进展

顾 召,夏联恒,林 权,王婷萱,高 杰

(1. 黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2. 黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

全球约有4.63亿糖尿病患者,糖尿病的发病率呈上升趋势,预估2030年将达5.78亿[1],随着我国老年人口比重逐年上升,糖尿病患者已远超1.45亿[2]。约30%糖尿病患者伴发糖尿病创面,在全身糖代谢异常影响下,局部氧化应激损伤、慢性炎症等因素制约糖尿病创面愈合,形成慢性创面,其中糖尿病足溃疡是下肢非创伤性截肢的主要原因[3]。糖尿病创面难愈增加创面感染风险,感染进一步加重可导致患者死亡。临床上多以“TIME”(tissuenonviable,infection/inflammation,moisture imbalance,egdge of wound)原则,指导糖尿病创面的治疗,局部清创后复杂的炎症机制及大量渗出物制约着传统敷料的应用[4]。壳聚糖是制备新型敷料的理想原料,具有良好的生物相容性、表面活性、生物降解性、无毒性。壳聚糖新型敷料能吸收渗出物,建立创面局部潮湿环境,为气体交换提供空间,预防感染、易清除,通过负载多种物质有效给药,促进糖尿病创面组织再生[5]。壳聚糖还具有多种药学特性,能从多方面促进创面愈合。壳聚糖可以进一步衍生化,在保留壳聚糖特有性质的基础上,提升了适应伤口环境的能力,扩大了壳聚糖的应用范围。随着对壳聚糖及其衍生物在生物医学领域研究深入,近年研究发现,壳聚糖及其衍生物能通过抗氧化应激损伤、调节巨噬细胞极化、促进血管生成等方面促进糖尿病创面愈合。本文就壳聚糖及其衍生化、药理作用、壳聚糖及其衍生物促进糖尿病创面愈合展开论述,为壳聚糖及其衍生物促进糖尿病创面愈合提供新思路。

1 壳聚糖及其衍生物

壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物,是一种天然碱性多糖,无毒,且具有多种生物活性,如生物降解性、生物相容性、抑菌、抗癌、降脂、增强免疫性等。壳聚糖溶解性差,不溶于水和大多数有机溶剂,限制了壳聚糖的应用。壳聚糖分子有C-6位伯羟基、C-3位仲羟基以及C-2位的伯氨基等较强反应活性的官能团,可通过官能团的取代,赋予壳聚糖各种功能特性[6],得到较好生物相容性、生物活性、抑菌活性及其他优异活性的壳聚糖衍生物,进一步扩大壳聚糖应用范围。

壳聚糖的酰化反应主要是利用分子链上的氨基和羟基与多种有机酸及有机酸衍生物发生反应,在分子链上引入脂肪基团或芳香基团[7],破坏分子内、分子间氢键,提高水溶性,是壳聚糖最常见的衍生化反应,见图1。N-酰化是指氨基发生酰化形成酰胺的反应,当C-2位存在保护基团时,酰化反应发生在C-6位的羟基上,称为O-酰化。壳聚糖酰化反应能提高壳聚糖的抗菌[8]、抗氧化性[9]。壳聚糖烷基化反应原理与酰化反应基本一致,通过将烷基引入壳聚糖分子链上C-3、C-6位的羟基及C-2位氨基,而形成含烷基的壳聚糖衍生物,见图1。烷基为疏水基团,所引入烷基链长度能影响壳聚糖烷基化衍生物的水溶性[10]。烷基化反应能提高壳聚糖的凝血及抗菌性[11]。壳聚糖的羧基化反应主要是利用氯代链烷酸或乙醛酸与壳聚糖分子链上氨基与羟基发生反应,C-6位的羟基最易取代,其次是C-3位的羟基,难度最大的是C-2位的氨基,见图1。羧基化壳聚糖具有良好的水溶性,并能溶于碱性溶液。目前,壳聚糖的羧化反应研究多集中于羧甲基化反应,羟甲基化壳聚糖具有抗菌、促进创面愈合、降脂、抗动脉硬化、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、降血糖等作用,在生物医学和医药领域具有重要的应用价值[10]。壳聚糖的衍生化还包括季铵化、硫醇化、羟基烷基化、酯化、磺化等,所制备的壳聚糖衍生物在溶解度、生物活性、材料结合能力等方面均较壳聚糖有不同程度的提高,拓展了壳聚糖在医学领域的应用。

图1 壳聚糖官能团的取代

2 壳聚糖药理作用

2.1抗菌作用 壳聚糖抗菌谱广,能抑制革兰阳性菌,革兰阴性菌及真菌的生存能力,起到抗菌作用。壳聚糖的抗菌机制目前尚不明确,主流观点认为壳聚糖胺基正电荷与细菌表面带负电荷的磷壁酸、脂多糖通过静电相互作用,改变细菌表面阴离子分布,影响细胞壁稳定性,破坏细胞膜,促使细胞裂解[12-13]。也有观点认为,低分子量壳聚糖能透过细胞膜与DNA结合,影响DNA聚合酶、RNA聚合酶功能,干扰遗传物质的转录和翻译,阻碍细菌增殖[14]。壳聚糖是一种金属螯合剂,能与细菌细胞膜表面金属离子螯合,破坏细胞膜稳定性,影响细胞正常功能,螯合金属离子还影响细菌营养物质的吸收[15]。壳聚糖还可以作为闭塞性化合物在细菌表面沉积,阻止细菌与外界物质交换导致细菌死亡。壳聚糖与磷脂相互作用选择性抑制真菌,抗真菌活性与细胞质膜流动呈正相关。相较抗生素而言,壳聚糖抗菌活性弱,不能有效抑制多种细菌[16],多项壳聚糖脱乙酰化、分子量大小、溶解介质的研究发现,壳聚糖分子量及溶解介质pH值改变能增强壳聚糖抗菌活性[17-18]。壳聚糖衍生化研究发现,席夫碱反应是提高壳聚糖抗菌活性的最佳方法之一[19]。羧基化反应能提高壳聚糖抗菌活性,磺化、季铵化反应能增强壳聚糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性,磺化反应还可以加强壳聚糖选择性抑制真菌[20]。

2.2止血作用 带正电荷的壳聚糖分子与带负电荷的红细胞,通过静电相互作用促进红细胞聚集,开始凝血过程,带正电荷的壳聚糖能活化血小板、吸附血红蛋白,促使血小板黏附聚集,释放促凝物质,提高血小板膜受体糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的表达,抑制纤维蛋白溶解,加速形成纤维蛋白网络[21]。壳聚糖烷基化反应能更好地促进凝血[22],壳聚糖季铵化反应可用于不可压迫性出血的止血[23]。

2.3抗氧化作用 壳聚糖分子链上的氨基和羟基能中止自由基参与的链式反应,有效清除人体内过多的自由基,从而起到抗氧化作用。壳聚糖抗氧化活性取决于短链分子内氢键及游离的氨基、羟基[24],多羟基、氨基抗氧化剂具有较好的生物活性。Park等[25]为提高其抗氧化活性,通过对不同分子量及脱乙酰化壳聚糖进行实验,结果显示低分子量、高脱乙酰化的壳聚糖抗氧化活性更好。有实验研究将富马酸甲酯引入到壳聚糖的氨基上,以及与酚酸结合均能提高壳聚糖的抗氧化活性[26-27]。羧甲基化、酰化、季铵化及接枝共聚物化反应均能增强壳聚糖抗氧化活性[28]。

2.4免疫调节作用 壳聚糖对固有免疫、特异性免疫均有作用,作为佐剂能调节免疫应答。多项研究表明,壳聚糖能刺激固有免疫,增加噬中性粒细胞数量,保持巨噬细胞活性,诱导自然杀伤细胞分泌细胞因子,激活多种细胞的免疫效果,特异性免疫中壳聚糖能增加T淋巴细胞活性,促使免疫球蛋白浓度增加[29-31]。在壳聚糖分子上引入活性基团可以加强免疫调节[32],三甲基氯化壳聚糖铵可诱导较强的全身和黏膜免疫反应[33],壳聚糖/O-HTCC纳米颗粒可增加小鼠抗原提呈细胞的活性[34]。壳聚糖可作为药物传递系统,靶向运送药物,是良好的免疫佐剂,季铵化壳聚糖在免疫佐剂方面有良好的研究空间[35]。除上述功能外,壳聚糖还具有黏膜黏附、镇痛、降压、抗胆固醇、抗糖尿病等多种药理作用,广泛应用于医学领域中。

3 壳聚糖及其衍生物作用于糖尿病创面机制

伤口愈合是复杂有序的生理过程,一般分为止血、炎症、增生、重塑四个重叠阶段。皮肤组织完整性遭到破坏,创面血管反射性收缩,血小板聚集,激活凝血系统,形成血凝块,并释放生长因子,启动修复过程;止血后,被召集到创面的中性粒细胞及单核细胞分化的巨噬细胞清除细菌及坏死组织,建立免疫屏障后,巨噬细胞释放多种生长因子,促进血管生成;新生血管与内皮细胞、成纤维细胞构成的肉芽组织填充缺损区域,促进创面愈合;成纤维细胞产生的Ⅲ型胶原被Ⅰ型胶原取代,细胞外基质转化瘢痕,完成创面愈合[36]。糖尿病创面难愈机制目前尚未明确,多与局部高糖微环境,氧化应激损伤、新生血管障碍、持续炎症状态及感染等多因素破坏细胞因子愈合过程有关,导致创面延迟愈合形成慢性创面[37]。

3.1抗氧化应激损伤 皮肤组织缺损,皮肤屏障遭到破坏,大量在伤口处聚集的免疫细胞能产生过氧化物,清除入侵病原微生物,所生成的活性氧含量决定愈合速度,适量活性氧能加速细胞因子和生长因子等释放,促进血管生成及组织愈合,而大量活性氧则会造成氧化应激损伤,阻碍愈合过程。糖尿病创面局部高糖微环境导致非酶促糖基化反应,产生晚期糖基化终末产物,影响细胞物质交换,晚期糖基化终末产物堆积,增强氧化应激反应,产生的过量活性氧,诱导细胞凋亡,延迟愈合[38]。高血糖还能直接升高金属蛋白酶活性,降低金属蛋白酶抑制因子的表达与氧化应激反应,降解细胞外基质,延迟细胞迁移和抑制胶原沉积延迟愈合[39]。壳聚糖能有效提高抗氧化酶活性,清除多余自由基,是良好的抗氧化剂。Anushree等[40]用二甲基甲酰胺对壳聚糖进行磷酸化,并进行修饰制备磷酸化壳聚糖(PC)。为测定PC抗氧化性,体外通过对铁还原、脂质过氧化物和超氧化物清除能力进行实验,结果显示PC具有良好的抗氧化能力。为探究PC在糖尿病创面应用潜力,对糖尿病切除性伤口大鼠模型进行干预,通过伤口测量、组织病理学检测及伤口中超氧化物歧化酶活性、脂质过氧化物进行检测,结果显示PC在糖尿病创面中具有良好的抗氧化能力,并促进创面愈合,PC可作为糖尿病创面愈合的有效治疗剂。

3.2调节巨噬细胞极化 适度炎症有助于创面愈合,炎症反应早期出现的M1型巨噬细胞,通过分泌炎症因子、炎症趋化因子,促进创面炎症反应,增强创面坏死组织和细胞的清除,防止细菌侵袭。炎症反应后期创面局部巨噬细胞数量逐渐减少,剩余巨噬细胞最终会转变为M2型巨噬细胞,M2型巨噬细胞释放转化生长因子-β(TGF-β)和血管内皮生长因子(VEGF)来促进血管生成,也可以释放血管活性物质,提高血管生成能力,减轻创面的炎症反应,使创面局部细胞得到增殖以及血管化[41]。高血糖、氧化应激等因素通过调节表观遗传密码导致巨噬细胞极化功能障碍,M1型巨噬细胞的数量和比例增高,使糖尿病创面处于慢性炎症状态,延迟愈合[42]。壳聚糖对巨噬细胞极化具有调控作用[43]。朱萌等[44]为验证水溶性壳聚糖制备敷料能力及在慢性创面的功能,对壳聚糖进行化学修饰,制备水溶性壳聚糖,将聚乙烯醇、明胶、水溶性壳聚糖,以循环冻融法制备水溶性壳聚糖水凝胶敷料,通过干预糖尿病小鼠感染全层皮肤缺损创面,发现水溶性壳聚糖水凝胶敷料能有效控制创面感染,促进创面愈合,且新生组织血管密度较高,通过比较Raw264.7巨噬细胞中CD206阳性细胞百分率,证明水溶性壳聚糖凝胶敷料可诱导巨噬细胞向M2型极化,从而修复慢性创面。

3.3促进巨噬细胞转分化 骨髓源性巨噬细胞能转分化为成纤维细胞,成纤维细胞合成胶原和细胞外基质,参与肉芽组织生成,巨噬细胞转分化而成的成纤维细胞主导创面愈合[45-46]。糖尿病创面愈合过程中,巨噬细胞转分化受抑制,创面胶原沉积受限,影响创面愈合。硫酸壳聚糖(SCS)是一种肝素样物质,通过调节巨噬细胞极化及炎症因子分泌促进骨修复。为验证SCS在慢性糖尿病创面中的效果,Shen等[47]制备了一种掺杂SCS的Ⅰ型胶原(ColⅠ/SCS)水凝胶,其可通过减少小鼠慢性糖尿病创面M1型巨噬细胞极化,白细胞介素(IL)-6的产生,增加了IL-4和TGF-β1的产生,加速炎症消退;此外,ColⅠ/SCS水凝胶还能促进巨噬细胞向成纤维细胞的转分化,从而促进伤口组织中胶原和细胞外基质的形成。

3.4促进血管生成 血管内皮细胞增殖及基底层细胞激活,有助于创面血管生成及创面恢复,高血糖是内皮细胞功能障碍的潜在因素,在持续性炎症状态下,生长因子缺乏,影响糖尿病创面细胞增殖及血管化[48]。Gao等[49]采用壳聚糖凝胶干预糖尿病大鼠慢性创面模型,发现壳聚糖凝胶能促进血管生成及创面愈合,通过对创面肉芽组织中血管内皮细胞RNA测序,发现壳聚糖通过诱导CAV1高水平表达,促进Wnt信号通路活性,加速血管生成。

3.5抑制生物膜活性 通过宏基因组学研究发现,金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、假单胞菌、大肠杆菌、真菌等微生物感染能延迟糖尿病创面愈合[50]。糖尿病创面病原微生物感染常以生物膜形式存在,生物膜能保护病原微生物免受抗菌药物和免疫系统的影响,通过群体感应改变微生物的增殖速度、代谢活动,持续刺激先天免疫系统,导致糖尿病创面延迟愈合[51]。多项关于壳聚糖抗菌作用研究表明,壳聚糖纳米微粒能抑制细菌、真菌生物膜活性[52-53],可能与促进糖尿病创面愈合有关。

4 讨论与展望

糖尿病创面难愈是全球医疗系统面临的棘手问题,壳聚糖具有抗菌、抗氧化、止血、免疫调节等多种药理作用,因其固有理化性质限制了壳聚糖的应用。壳聚糖分子链上反应活性的官能团可通过酰化、烷基化、羟基化等反应,制备溶解性、药理活性更强的壳聚糖衍生物,进一步扩大壳聚糖在医疗领域的应用。多学科研究表明,壳聚糖及其衍生物能通过抗氧化应激损伤、调节巨噬细胞极化、促进巨噬细胞转分化、加速血管生成、抑制生物膜活性,促进糖尿病创面愈合[54]。壳聚糖及其衍生物促进糖尿病创面愈合与壳聚糖的抗菌、抗氧化等作用有关,其具体信号通路尚未明确,作用机制有待深入研究。

壳聚糖在自然界中含量丰富,获取简便,具有靶向传递、无毒、可生物降解等多种作用,广泛应用于生物医疗领域。壳聚糖作为生物聚合物在皮肤、骨、肾脏、神经、肝脏、伤口愈合等方面已显示出应用潜力,具有广阔应用前景。近年来,组织工程学研究发现壳聚糖在神经修复中具有正向作用,部分壳聚糖衍生物能增强干细胞增殖、分化潜能,壳聚糖及其衍生物促进糖尿病创面愈合可作为新的研究方向。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。